Visualisatie van hittebehandelde virale capsiden met transmissie-elektronenmicroscopie

Neem de buisjes met virale capsiden, wat virusachtige deeltjes zijn zonder genetisch materiaal.

Verhit de buizen bij een constante temperatuur gedurende variërende tijdsduuren.

Een kortere verhittingsduur veroorzaakt milde stress bij de capsideproteïnen, terwijl langdurige verhitting het capside verstoort en aggregatie veroorzaakt.

Koel de buisjes snel af om verdere structurele veranderingen te voorkomen.

Breng de vloeistof over op een paraffinefolie.

Plaats een transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) grid op de druppel. De capsiden hechten zich aan het oppervlak van het grid.

Deponeren het grid op filterpapier om overtollige vloeistof te verwijderen.

Was met een buffer om losjes gebonden capsiden te verwijderen en dep het rooster vervolgens opnieuw droog.

Dompel in uranylacetaat, een zwaar metaalcontrastmiddel dat bindt aan het oppervlak van het capsid, waardoor deze donkerder verschijnen onder TEM.

Depot het grid op filterpapier en plaats het op een plaat. Bewaar de plaat in een desiccator om vocht te verwijderen.

Maak beelden van het grid met behulp van TEM om hitte-geïnduceerde schade aan het capsid te visualiseren.

Voer de hittebehandeling uit zoals eerder beschreven, maar vervang 10 millimolair HEPES, pH 7.4 door PBS en verdun de capsiden na de behandeling niet verder. Pipetteer vervolgens de volledige druppel van 15 microliter van de behandelde capsid-oplossing op paraffinefolie. Pak de rand van het raster met een pincet, waarbij de pincet op de rand sluit om het raster vast te houden, en plaats het raster met de koolstofzijde naar beneden bovenop de druppel van de behandelde oplossing.

Laat het raster 10 minuten incuberen zodat het capsid zich aan het raster kan hechten. Afhankelijk van de zuiverheid van de capsid-preparatie kunnen wasstappen met de HEPES-oplossing worden toegevoegd in de vorm van druppels van 10 tot 15 µL, die in een lijn achter de druppel met het behandelde capsid worden geplaatst. Til het raster na 10 minuten samen met de druppel op.

Plaats het raster bijna loodrecht op een stuk filterpapier om de druppel weg te zuigen. Gebruik het raster vervolgens om de druppel van 10 tot 15 µL HEPES-buffer op te nemen en houd dit 30 seconden vast. Na een wastijd van 30 seconden wordt de vloeistof met een ander stuk filterpapier weggezogen.

Plaats vervolgens een druppel van 15 µL 2% uranylacetaatoplossing op de paraffinefilm op een leeg gedeelte. Neem de druppel uranylacetaat op met het raster en houd dit 45 s vast. Trek daarna het uranylacetaat weg, waarbij u ervoor zorgt dat het grootste deel van de oplossing wordt verwijderd.

Plaats het raster met de koolstofzijde naar boven op een stuk filterpapier, waarbij u erop let dat het raster niet aan het vocht op de pincet blijft plakken. Plaats vervolgens het filterpapier met het raster erop in een open glazen Petri-schaal. Nadat dit proces voor alle behandelingen is herhaald, worden de helften van de Petri-schaal met de rasters gedurende de nacht in een desiccator geplaatst om te drogen voorafgaand aan de observatie met TEM.