Phage Purification from Borrelia burgdorferi
JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 4:30 min • July 31st, 2026
Take a suspension of Borrelia burgdorferi bacteria infected with a borrelial phage.
Centrifuge the suspension and collect the supernatant containing phage particles and cellular debris.
Add a salt solution and incubate with shaking.
The salt solution enables the separation of residual host-derived macromolecules from the phage particles.
Centrifuge the suspension and collect the supernatant containing the phage particles.
Add polyethylene glycol or PEG, which acts as a molecular crowding agent that facilitates phage particle precipitation.
Incubate on ice and then centrifuge.
Discard the supernatant.
Resuspend the pellet in a buffer, then transfer it to a microcentrifuge tube.
Treat with chloroform to dissolve lipid-based cell debris.
Centrifuge the tube and collect the upper aqueous phase containing the borrelial phages.
Repeat the chloroform addition, mixing, centrifugation, and collection steps to ensure complete removal of contaminants.
Store the isolated phage particles under cold conditions for further use.
Supplement the prepared culture with the appropriate antibiotic concentration described in the manuscript, while incubating the sample at 33 degrees Celsius for 72 to 96 hours. To prepare solutions for PEG precipitation, prepare 500 milliliters of five molar sodium chloride, 500 milliliters of 40% PEG, and 100 milliliters of suspension medium as described in the manuscript. To sterilize, autoclave the solution, cool prior to use, and store at room temperature or four degrees Celsius.
For PEG precipitation of phage from the donor Borrelia burgdorferi clone, after 72 to 96 hours of incubation, centrifuge the samples at 8,000 g for 20 minutes at four degrees Celsius. Decant the supernatant into a clean, 50-milliliter conical tube and dispose of the cell pellet. Add five molar sodium chloride to a final concentration of one molar.
After mixing well, rock gently at room temperature for one hour. Centrifuge the samples at 8,000 g for 10 minutes at four degrees Celsius. After decanting the supernatant into a clean 50-milliliter conical tube as demonstrated previously, add 40% PEG-8000 solution to the supernatant to a final concentration of 10%. Mix well and set on ice for more than one hour, up to overnight.
Centrifuge the samples at 8,000 g for 20 minutes at four degrees Celsius as demonstrated previously. Discard the supernatant and remove as much excess liquid as possible without losing any pellet, which contains the phage particles. Resuspend the pellet in a minimal volume of suspension medium using the suspension medium to wash down the side of the bottle and collect any potential phage particles.
Treat the recovered phage sample with an equal volume of chloroform based on the volume of resuspension. Mix the sample well and centrifuge at 8,000 g for 10 minutes. Then, remove the aqueous layer to a clean tube, avoiding any of the thick interface layers.
After determining the volume recovered following the first chloroform treatment, again treat the sample with an amount of chloroform equal to 10% of that volume. Transfer the aqueous layer to a clean tube while being careful to avoid any of the interface or organic layers. Use the phage immediately or store it at four degrees Celsius.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol voor het isoleren van borrelia-faagdeeltjes uit suspensies van Borrelia burgdorferi middels polyethyleenglycol (PEG)-gemedieerde precipitatie en chloroformextractie. De methode stelt onderzoekers in staat om gezuiverde faagdeeltjes te verkrijgen voor verdere genetische manipulatie en studie van de spirocheet die de ziekte van Lyme veroorzaakt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Microbiologie
- Moleculaire Biologie
- Bacteriofaagonderzoek
Achtergrond
- Borrelia burgdorferi is het veroorzakende agens van de ziekte van Lyme.
- Fagen-gemedieerde genetische manipulatie is een waardevol instrument voor het bestuderen van bacteriële genetica.
- Efficiënte isolatie van fagenpartikels is essentieel voor genetische studies en toepassingen.
- PEG-precipitatie en chloroformextractie zijn gevestigde methoden voor de zuivering van fagen.
Doel van de studie
- Om een betrouwbaar protocol te demonstreren voor het isoleren van borrelia-faagdeeltjes uit geïnfecteerde B. burgdorferi-culturen.
- Om gedetailleerde stappen te bieden voor faagzuivering die geschikt zijn voor genetische manipulatie-experimenten.
- Om de verwijdering van cellulair debris en contaminanten uit faagpreparaten te waarborgen.
Gebruikte methoden
- Centrifugatie van geïnfecteerde B. burgdorferi-suspensies om het fagenbevattende supernatant te scheiden.
- Toevoeging van een zoutoplossing om de scheiding van macromoleculen van de gastheer te vergemakkelijken.
- PEG-gemedieerde precipitatie van fagenpartikels, gevolgd door incubatie op ijs en verdere centrifugatie.
- Chloroformextractie om lipide-gebaseerd debris te verwijderen, met herhaalde stappen om de zuiverheid te waarborgen.
- Resuspensie van de fagenpellet in buffer en bewaring onder koude omstandigheden.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie en concentratie van borrelia-faagdeeltjes uit bacteriële culturen.
- Effectieve verwijdering van cellulair debris en contaminanten door middel van sequentiële centrifugatie en chloroformextractie.
- Bereiding van gezuiverde fagen die geschikt zijn voor direct gebruik of koude bewaring.
- Het protocol ondersteunt downstream-toepassingen voor genetische manipulatie van B. burgdorferi.
Conclusies
- Het beschreven protocol maakt een efficiënte en reproduceerbare isolatie van borreliale fagen mogelijk.
- PEG-precipitatie in combinatie met chloroformextractie levert fagenpreparaten van hoge zuiverheid op.
- Deze methode faciliteert geavanceerde genetische studies in B. burgdorferi en aanverwante onderzoeken.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Efficiënte zuivering van borreliale faagpartikels uit Borrelia burgdorferi-culturen maakt nauwkeurige genetische manipulatie en functionele studies mogelijk in het onderzoek naar de ziekte van Lyme. Deze mogelijkheid ondersteunt targetvalidatie in een vroeg stadium en het mechanistisch verminderen van risico's voor portfolio's van infectieziekten. Betrouwbare faagisolatie vormt de basis voor reproduceerbare workflows voor de ontwikkeling van genetische instrumenten en translationeel onderzoek.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Maakt onderzoek naar genfunctie en pathway-analyse in B. burgdorferi mogelijk.
- Ondersteunt biologische risicoreductie door het leveren van gezuiverde fagen voor genetische manipulatie.
- Vergemakkelijkt voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie via gecontroleerde genetische studies.
Screening & Assayontwikkeling
- Levert fagenvoorraden van hoge zuiverheid voor gestandaardiseerde genetische assays.
- Verbetert de reproduceerbaarheid en kwantitatieve output in downstream screeningworkflows.
- Maakt schaalbare preparatie van genetische tools mogelijk voor platforms voor verbindingsevaluatie.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Ondersteunt de ontwikkeling van ziekterelevante genetische modellen voor onderzoek naar de ziekte van Lyme.
- Waarborgt de continuïteit van ontdekking tot preklinische validatie door nauwkeurige genetische modificaties mogelijk te maken.
- Vermindert mechanistische ambiguïteit in translationele studies door betrouwbare faag-gemedieerde manipulatie.
Integratie van pipeline en workflow
Dit protocol voor fagenzuivering bevindt zich op het snijvlak van vroege ontdekking en de ontwikkeling van genetische instrumenten, ter ondersteuning van workflows variërend van hypothesetesten tot het genereren van preklinische modellen.
- Ontdekkingsbiologie: Maakt hypothese-gestuurde genetische manipulatie en padverduidelijking in B. burgdorferi mogelijk.
- Screening: Levert reproduceerbare, hoogzuivere faagvoorraden voor de ontwikkeling en validatie van assays.
- Analytica: Levert kwantitatieve faagopbrengsten en zuiverheidsmetrieken voor vergelijking tussen verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Faciliteert de generatie van genetisch gemodificeerde stammen voor ziekte-relevante studies.
- Bedrijfsmatige hergebruik: Vestigt een gestandaardiseerd, herbruikbaar protocol voor faagzuivering over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen en vermindert de mechanistische onzekerheid in genetische studies.
- Operationele waarde: Standaardiseert fagenzuivering voor reproduceerbaarheid en schaalbaarheid.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door het mogelijk maken van robuuste generatie van genetische instrumenten.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risico-gecorrigeerde prioritering van onderzoeksprogramma's naar infectieziekten.
Overwegingen voor de implementatie
- Vereist expertise in faagbiologie en moleculair microbiologische technieken.
- Toegang tot centrifugatie, koude opslag en infrastructuur voor de omgang met chemicaliën is noodzakelijk.
- Standaardisatie tussen teams is vereist voor reproduceerbare faagopbrengsten en zuiverheid.
- Aanpassing voor verschillende bacteriële gastheren of faagtypen kan noodzakelijk zijn.
- Afhankelijk van zorgvuldige fasescheiding en stappen voor het verwijderen van contaminanten.
Veelgestelde vragen over Biofarmacie
Een Geoptimaliseerd Verrijking Techniek voor de isolatie van
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Synthese van besmettelijke bacteriofagen in een e-coli -gebaseerd systeem van cel-vrije expressie
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Na Cell-lot in
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Preparation and Induction of Borrelia burgdorferi Cultures for Viral Particle Production
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Purification of Bacteriophages Using a Sucrose Density Gradient
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Amplification and Recovery of Infectious Bacteriophages
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Essentiële componenten van Borreliella (Borrelia) burgdorferi In Vitro Transcriptie Assays
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Faag-gemedieerde genetische manipulatie van de ziekte van Lyme Spirochete Borrelia burgdorferi
Gerelateerde video's
0 Bekeken
Laatst bijgewerkt: 22 augustus 2026