JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:28 min • August 31st, 2026
Neem een cultuur van genetisch gemodificeerde spirocheet-bacteriën. Deze bacteriën dragen het gentamicin-resistentiegen.
Voeg een bacteriofaagsuspensie toe aan de bacteriële cultuur.
De fagen dragen plasmiden-DNA dat codeert voor een kanamycin-resistentiegen.
Incubeer het mengsel.
De bacteriofaag hecht zich aan het bacterieoppervlak en injecteert het DNA in de cel.
Het plasmide repliceert onafhankelijk en wordt doorgegeven wanneer de bacteriën zich delen.
Meng de geïncubeerde cultuur met een gesmolten agarose-medium dat is aangevuld met de antibiotica gentamicine en kanamycin.
Giet het mengsel in een petrischaal. Laat het stollen en incubeer het vervolgens.
Onder selectie met twee antibiotica groeien en vormen alleen cellen die beide resistentiemarkers dragen koloniën, terwijl de overige cellen afsterven.
Kies een kolonie en inoculeer deze in een medium dat beide antibiotica bevat.
Incubeer om de groei van bacteriën met het getransduceerde plasmide te bevorderen voor verdere downstream-analyse.
Giet het supernatant af en resuspendeer de pellet in 14,5 milliliters vers BSK. Voeg minder dan of gelijk aan 50 microliters van het PEG-geprecipiteerde faagmonster toe aan de cultuur van de ontvangende kloon.
Incubeer na goed mengen gedurende 72 tot 96 uur bij 3 graden Celsius. Voer de selectie van transductanten uit via plating op vaste fase na menging met PEG-geprecipiteerde fagen, zoals beschreven in het manuscript. Controleer, afhankelijk van de achtergrond van de recipiënt-kloon, of de kolonies na 10 tot 21 dagen incubatie in de agarose op de selectieplaten verschijnen.
Select ten tot minimaal vijf kolonies die op de plaat groeien in de aanwezigheid van beide antibiotica met een gesteriliseerde borosilicaatpipet van 5,75 inch met katoenplugg, en inoculeer deze in 1,5 milliliters BSK met het juiste antibioticum.