Name: Methoden Ontwikkeling voor Blood Borne Macrofaag vervoer van Nanoformulated antiretrovirale geneesmiddelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 46 s
Description: Leer de productie en test van nanoART-antiretrovirale nanodeeltjes voor verbeterde celopname en afgifte door macrofagen. Deze methode ondersteunt HIV-therapieonderzoek met verbeterde farmacokinetiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Het werk werd ondersteund door subsidies 1P01DA028555-01A1, 2R01 NS034239, 2R37 NS36126, P01 NS31492, P20RR 15.635, P01MH64570, en P01 NS43985 (tot HEG) van de National Institutes of Health. De auteurs danken mevrouw Robin Taylor voor de kritische lezing van het manuscript en uitstekende grafische en literaire ondersteuning. We willen graag Steve GRZELAK bedanken voor zijn natte-frezen expertise. Wij zouden ook graag dr. Han Chen van de Universiteit van Nebraska-Lincoln elektronenmicroscopie kernfaciliteit bedanken voor het leveren van de scanning en transmissie elektronenmicroscopie beelden. Tot slot willen we Megan Marquart bedanken voor haar expertise met behulp van live confocale microscopie.

<ol><li>Gendelman, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+and+propagation+of+human+immunodeficiency+virus+on+recombinant+colony-stimulating+factor+1-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation and propagation of human immunodeficiency virus on recombinant colony-stimulating factor 1-treated monocytes.</a> J Exp Med. 167 (4), 1428-1441 (1988).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+macrophage-based+nanoparticle+platform+for+antiretroviral+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Development of a macrophage-based nanoparticle platform for antiretroviral drug delivery.</a> Blood. 108 (8), 2827-2835 (2006).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+investigations+for+the+morphologic%2C+pharmacokinetic%2C+and+anti-retroviral+properties+of+indinavir+nanoparticles+in+human+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Laboratory investigations for the morphologic, pharmacokinetic, and anti-retroviral properties of indinavir nanoparticles in human monocyte-derived macrophages.</a> Virology. 358, 148-158 (2007).</li>
<li>Dou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+delivery+of+nanoformulated+antiretroviral+drug+to+the+brain+in+a+murine+model+of+neuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage delivery of nanoformulated antiretroviral drug to the brain in a murine model of neuroAIDS.</a> J Immunol. 183 (1), 661-669 (2009).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoformulated+Antiretroviral+Drug+Combinations+Extend+Drug+Release+and+Antiretroviral+Responses+in+HIV-1-Infected+Macrophages%3A+Implications+for+NeuroAIDS+Therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nanoformulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV-1-Infected Macrophages: Implications for NeuroAIDS Therapeutics.</a> J Neuroimmune Pharmacol. , (2010).</li>
<li>Nowacek, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NanoART+synthesis%2C+characterization%2C+uptake%2C+release+and+toxicology+for+human+monocyte-macrophage+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomed%22%5BJournal%5D)">NanoART synthesis, characterization, uptake, release and toxicology for human monocyte-macrophage drug delivery.</a> Nanomed. 4 (8), 903-917 (2009).</li>
<li>Kalter, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+HIV+replication+in+macrophage+colony-stimulating+factor-treated+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Enhanced HIV replication in macrophage colony-stimulating factor-treated monocytes.</a> J Immunol. 146 (1), 298-306 (1991).</li>
</ol>

NanoArt zijn ontworpen om HIV-1 therapeutica te verbeteren. We hebben voorgesteld een monocyt-macrofaag op basis van drug delivery systeem als een eerste stap om dergelijke technologieën te ontwikkelen voor klinisch gebruik en als een laboratorium testsysteem voor nanoformulated de ontwikkeling van geneesmiddelen. Ons verleden werken hebben aangetoond dat het systeem is haalbaar voor een dergelijke toepassing 5,6. In het huidige rapport, hebben wij geïllustreerd methodes voor het synthetiseren van NP van veelgebruikte hiv-1-medicatie (indinavir, IDV, ritonovir, RTV, efavirenz, EFV en atazanavir, ATV). Dit werd bereikt door nat frezen, homogenisering en ultrasone trillingen. Belangrijk is dat onze aanpak zorgt voor wijzigingen van NanoArt fysieke kenmerken zoals grootte, vorm en lading 5,6. Door zorgvuldige selectie van oppervlakteactieve stoffen, kan men de lading van het deeltje van zeer negatieve controle op neutraal tot zeer positief. Door het veranderen van de doorlooptijd en intensiteit, kan men de grootte en maken deeltjes zo klein als ≤ 200 nm of zo groot als ≥ 3 micrometer. De vorm van het deeltje kan ook worden geregeld, maar in mindere mate dan de andere fysieke kenmerken. Kan bijvoorbeeld bolvormige deeltjes worden gemaakt via sonicatie met polymeren, terwijl multi-zijdige geometrische vormen kan worden geproduceerd via natmalen of homogenisering. Nat frezen en homogenisering produceren verschillend gevormde deeltjes, maar dit proces is afhankelijk van de fractionering methode en kan niet direct worden gecontroleerd voor. Deze eigenschappen van de fabricagemethoden kunt inschakelen onderzoeken om gemakkelijk te produceren NanoArt om de exacte specificaties van het ontwerp. Dit is van vitaal belang, omdat de fysisch-chemische eigenschappen van NanoArt hebben een krachtig effect op zowel de stabiliteit en de manier waarop ze omgaan met cellen. Zo hebben we aangetoond dat NanoArt die ongeveer 1 micrometer in omvang, een sterke positieve lading hebben, en hebben een multisided geometrische vorm worden sneller opgenomen door macrofagen, meer stabiele eenmaal binnen de cellen, en bracht over een langere periode van tijd 6. Een methode voor het testen van NanoArt werd ontwikkeld die het mogelijk maakt voor een eenvoudige screening van de deeltjes &#39;vermogen om te worden opgenomen, behouden, en vrijgegeven door macrofagen, een van de belangrijkste doelwitcellen van HIV-1, in aanvulling op hun capaciteit om virale replicatie te remmen. Hierdoor kan een eenvoudig NanoArt differentiëren op basis van prestaties en degenen die de beste kans van slagen in een in vivo model, dus, waardoor zowel de efficiëntie en snelheid van de ontwikkeling van NanoArt voor menselijk gebruik zijn te identificeren. Het is aangetoond dat de muis beenmerg macrofagen als ex vivo geladen met NanoArt en adoptief overgedragen door intraveneuze injectie in gehumaniseerd HIV-1 geïnfecteerde muizen kunnen reizen naar sites van actieve infectie, waaronder het centrale zenuwstelsel, en laat geneesmiddelen voor maximaal 2 weken om virale replicatie remmen 2-4. Bovendien zijn deze NanoArt geladen cellen werden ook in staat om effectief het aantal virus-geïnfecteerde cellen te verminderen in het plasma, lymfeklieren, milt, lever en longen en CD4 + cellen 2 te beschermen. Deze studies, hoewel voorlopig, aan te tonen dat een cel-gemedieerde NanoArt aflevering systeem kan klinisch significante hoeveelheden van de drug te verdelen om zowel bloed en geïnfecteerde weefsels. Vanwege de bemoedigende voorlopige resultaten van HIV-1 geïnfecteerde muizen studies, zijn we op dit moment het ontwikkelen van een aap immuno-deficiëntie virus besmet makaak model verder te testen van de mogelijkheden van NanoArt voor klinisch gebruik.

Gebruikte afkortingen in de tabel: IDV: indinavir; RTV: ritonavir, ATV: atazanavir, EFV: effavirenz; PVA: polyvinylalcohol; SDS natriumdodecylsulfaat; P188: poloxameer 188 (ook wel Pluronic F68); mPEG 2000-DSPE: methyl-poly (ethyleen-glycol) 1,2-distearoyl-fosfatidyl-ethanolamine, DOTAP: (1-oleoyl-2-[6 - [(7-nitro-21 ,3-benzoxadiazol-4-yl) amino] hexanoyl] - 3-trimethylammonium propaan); PLGA: poly (melkzuur-co-glycolzuur), CTAB: cetyltrimethyl ammonium bromide; DMEM: Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium; MCSF: macrofaag kolonie-stimulerende factor, HPLC: hoge-druk vloeistofchromatografie, HIV-1 : Human Immunodeficiency Virus-1

methoden ontwikkeling voor blood borne macrofaag vervoer van nanoformulated antiretrovirale geneesmiddelen

Methods Development for Blood Borne Macrophage Carriage of Nanoformulated Antiretroviral Drugs

Nanoformulated drugs kunnen verbeteren farmacodynamiek en de biologische beschikbaarheid, terwijl die ook aan drugs toxiciteit te verminderen voor de antiretrovirale (ARV) medicijnen. Daartoe heeft ons laboratorium toegepast de principes van de nanogeneeskunde om ART regimes vereenvoudigen en als zodanig te verminderen toxiciteiten terwijl het verbeteren van de naleving en drugs farmacokinetiek. Eenvoudige en betrouwbare methoden voor de productie van nanoformulated ART (NanoArt) worden getoond. Deeltjes van pure drugs worden ingekapseld door een dunne laag van oppervlakte-actieve stof lipide coating en geproduceerd door fractionering van grotere kristallen drugs in kleinere door een nat malen of hoge druk homogenisatie. In een alternatieve methode vrij geneesmiddel wordt gesuspendeerd in een druppel van een polymeer. Hierin is het medicijn opgelost in een polymeer vervolgens geagiteerd door ultrasone trillingen totdat de individuele nanogrootte druppeltjes worden gevormd. Dynamische lichtverstrooiing en microscopisch onderzoek karakteriseren van de fysische eigenschappen van de deeltjes (deeltjesgrootte, lading en vorm). Hun biologische eigenschappen (cel-opname en retentie, cytotoxiciteit en antiretrovirale effectiviteit) worden bepaald met menselijke monocyt-afgeleide macrofagen (MDM). MDM afkomstig zijn van menselijke perifeer bloed monocyten geïsoleerd uit leukopacks gebruikmakend van centrifugaalkracht elutriatie voor zuivering. Dergelijke bloed overgedragen macrofagen kunnen worden gebruikt als cellulaire transporteurs voor NanoArt distributie naar het humaan immunodeficiëntie virus (HIV) geïnfecteerde organen. We stellen dat de ompakking van klinisch beschikbare antiretrovirale medicijnen in nanodeeltjes voor HIV-1 behandelingen kunnen naleving te verbeteren en een positieve invloed ziekte resultaten.

Nanodeeltjes van indinavir, ritonavir, efavirenz en atazanavir zijn vervaardigd met behulp van nat vermalen, homogenisering en ultrasone trillingen. Deze nanoformulations, gezamenlijk aangeduid als nanoformulated antiretrovirale therapie (NanoArt), beoordeeld macrofaag-based drug delivery. Monocyt-afgeleide macrofaag NanoArt opname, retentie en vertraagde afgifte werden bepaald. Deze voorbereidende studies suggereren de mogelijkheden van NanoArt voor klinisch gebruik.

Methoden Ontwikkeling voor Blood Borne Macrofaag vervoer van Nanoformulated antiretrovirale geneesmiddelen

Nanogeformuleerde geneesmiddelen kunnen de farmacodynamiek en biobeschikbaarheid verbeteren, terwijl ze tegelijkertijd kunnen dienen om de toxiciteit van antiretrovirale (ART) geneesmiddelen te verminderen. Om ...

Het doel van deze procedure is het produceren en testen van de cellulaire opname, secretie en antiretrovirale eigenschappen van kristallijne antiretrovirale nanodeeltjes, die wij nano art noemen. Dit wordt bereikt door de antiretrovirale geneesmiddelen eerst te verwerken via sonicatie-homogenisatie of nat malen. De tweede stap van de procedure is het karakteriseren van de fysische eigenschappen van de nano art-deeltjes nadat primaire monocyten zijn geïsoleerd via tegenstroomcentrifugatie.Ze worden zeven dagen gekweekt in DMEM met macrophage colony stimulating factor, of MCSF, wat hun differentiatie tot monocyten-afgeleide macrofagen induceert. De derde stap is het testen van de opname, retentie en afgifte van nano art in menselijke monocyten-afgeleide macrofagen. De laatste stap van de procedure is het testen van de in vitro antiretrovirale werkzaamheid van nano art in monocyten-afgeleide macrofagen.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de vergemakkelijkte opname en langzame afgifte van nano-art uit cellen en een robuuste antiretrovirale werkzaamheid aantonen. Deze worden bepaald door metingen van drugspiegels via hogedrukvloeistofchromatografie of HPLC en door het testen van geïnfecteerde cultuursuprenanten door middel van de meting van de reverse transcriptase-activiteit. Hallo, ik ben Hanta Aldi en ik ben postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Dr. Howard Gelman aan het University of Nebraska Medical Center.De methoden die we presenteren kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de nanomedicijnleer, waaronder hoe celgebaseerde systemen voor geneesmiddelentoediening kunnen worden ingezet om translationele onderzoeksactiviteiten te ontwikkelen. Dit kan worden bereikt door het gebruik van nano-geformuleerde antiretrovirale therapie met verlengde halfwaardetijden. Onze studies ondersteunenHet potentieel van nano-art voor klinisch gebruik.Hoi, mijn naam is Ari Noche en ik ben een MD-PhD-student onderzoeker werkzaam in het Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratory. Onder begeleiding van Dr. Gendelman reiken de implicaties van de technieken die wij hier laten zien tot antiretrovirale therapie, aangezien nano-geformuleerde verbindingen gelijktijdig de biologische beschikbaarheid en farmacokinetiek kunnen verbeteren, terwijl ze tegelijkertijd medicijngerelateerde bijwerkingen verminderen. Door klinisch beschikbare antiretrovirale medicatie te nemen en deze opnieuw te verpakken in nanodeeltjes, kunnen we mogelijk de therapietrouw verbeteren en een positief effect hebben op de ziekteuitkomsten.Hallo, ik ben Dr. Howard Gendelman. Ik ben klinisch wetenschapper en professor en hoofd van de afdeling Farmacologie en Experimentele Neurowetenschappen hier aan het University of Nebraska Medical Center. Ons algemene doel is om antiretrovirale geneesmiddelen te vereenvoudigen om ze gemakkelijker beschikbaar te maken en de biodistributie en farmacokinetiek te verbeteren.Ik geef nu het woord aan Ari en Sean, die u meenemen naar het onderzoekslaboratorium om te laten zien hoe de productie en ontwikkeling van deze nanodeeltjes worden uitgevoerd. Klinisch nut en ontwikkeling hier aan het University of Nebraska Medical Center. Om nano-art te produceren via nat malen: weeg eerst de geneesmiddelkristallen en de diverse surfactanten die worden gebruikt voor de nano-formuleringen en meng deze met 10 millimolar heis-buffer pH 7.8. Gebruik hiervoor een T 18 ultra Turx-mixer totdat alles volledig is gedispergeerd; het percentage van het geneesmiddel in de formulering moet tussen 1% en 2% liggen voor continu malen.Zorg ervoor dat de koeler en de compressor zijn ingeschakeld en dat de uitlaatdruk nu rond de 100 PSI ligt; stel het systeem vervolgens zo in dat het maalsmedium in de tank kan worden geladen en voeg 50 milliliters kralen toe aan de maalkamer. Gebruik een trechter en controleer of er geen kralen in de schroefdraad of elders buiten de maalkamer zitten om lekken in de mechanische afdichting te voorkomen. Controleer nu of de O-ring correct op zijn plaats zit in de maalkamer.Select vervolgens een geschikte maaswijdte voor het zeefgaas en bevestig de deksels door de moeren aan te draaien. De maaswijdte moet ten minste de helft van de grootte van de kralen bedragen. Gebruik een grote maaswijdte om te voorkomen dat het product het filter verstopt tijdens het continue malen.Nadat de maalkamer is neergelaten, voegt u de drug-suspensie met verschillende hoeveelheden surfactant toe aan de productinlaat. Het minimale volume van de suspensie moet 100 milliliters zijn. Dit voorkomt oververhitting van de maalkamer en vermindert bead-contaminatie door minder slijtage van de onderdelen.Start vervolgens de pomp. Gebruik de besturingseenheid om de stroomsnelheid aan te passen aan uw formulering. Zet daarna de roerder aan en stel de snelheid in op de besturingseenheid.De snelheid kan worden verhoogd van 600 omwentelingen per minuut tot 4.320 omwentelingen per minuut. Controleer bij een micro sur de temperatuur met de temperatuurmeter die bovenop de maalchamber is bevestigd om oververhitting te voorkomen. Maal het monster nu op verschillende snelheden en stroomsnelheden en neem kleine aliquots van ongeveer één milliliter van de formulering af voor grootte- en ladingsmetingen met behulp van een diffractie-lichtverstrooiings malvern zeta sizer.Zodra de gewenste grootte is bereikt, stopt u het malen via de bedieningseenheid en verzamelt u, terwijl de pomp nog aan staat, het monster in een fles, waarbij u het geneesmiddel volledig laat weglopen. Vergeet niet de pomp uit te schakelen wanneer u klaar bent, en verwijder en reinig de mallinkogels. Breng nu de malingsuspensie over in centrifugebuisjes van 50 milliliter en stel de centrifuge in op 10.000 toeren per minuut voor 30 minuten.Nadat de centrifugecyclus is voltooid, meet u de hoeveelheid bovenzit en vervangt u deze door dezelfde hoeveelheid verse surfactantoplossing. Zodra de resuspensie voltooid is, brengt u de suspensie over naar de maalkamer en maalt u deze gedurende 10 minuten. Neem een aliquot van ongeveer één milliliter en meet de grootte en lading van de monster opnieuw met de Zeta sizer.Meet ten slotte de concentratie van de nano-art formuleringen met behulp van HBLC om nano-art te produceren via homogenisatie. Bereid met de Avastin Emulex C five de drugkristallen en diverse surfactanten voor zoals eerder beschreven, breng de suspensie over naar het homogenisatievat en start de recirculatie. Zorg ervoor dat de chiller is ingeschakeld voordat u begint met het homogeniseren van het monster.Verhoog de druk geleidelijk totdat de meter 20.000 ± 2000 PSI aangeeft en homogeniseer verder tot de doelpartikelgrootte is bereikt. Dit duurt gewoonlijk tussen de 45 en 60 minuten. Neem periodiek een aliquot van ongeveer één milliliter en meet de grootte en lading van de monstername van de gehomogeniseerde suspensie met een zeta sizer centrifuge, zoals eerder beschreven.Overbreng na de Resus-suspensie de suspensie naar de C five homogenisator. Start de circulatie opnieuw op en breng de homogenisatiedruk terug naar 20.000 plus of minus 2000 PSI en homogeniseer gedurende 30 minuten om te vervaardigen via sonicatie met behulp van de cold Palmer ultrasone processor. Giet de chloormethaan PLGA- en geneesmiddeloplossing in een 1% PVA-surfactantoplossing en plaats deze in een ijsbad in de ultrasoon.Start de sonicatie bij 50% amplitude, hoewel de amplitude van de sonicatie kan worden verlaagd naar ongeveer 30% amplitude voor kleinere monsterbatches; soniceer het monster gedurende 10 minuten. Neem een klein aliquot af voor de analyse van de partikelgrootte. Indien de partikelgrootte groter is dan 1,5 micron, soniceer de monsters dan in intervallen van twee minuten tot een maximum van 16 minuten in totaal.Observeer de monsters onder de microscoop bij een 20-voudige vergroting en documenteer de waarnemingen. Gebruik een roerplaat om een adequate vortex voor de suspensie te creëren en meng deze gedurende de nacht bij kamertemperatuur verder. Verzamel de suspensie na 24 uur en giet deze over in centrifugebuizen van 50 milliliter.Centrifugeer de monsters bij een snelheid van 8.000 toeren per minuut gedurende 20 minuten bij 5 °C, decanteer het supernatant en resuspendeer de ene helft van het monster in 75 milliliters gefiltreerd omgekeerd osmosewater en de andere helft in 75 milliliters 0,5% CTAB trimethylammoniumbromide surfactant. Centrifugeer de monsters opnieuw bij een snelheid van 8.000 toeren per minuut gedurende 20 minuten bij 5 °C en resuspendeer elk van de pellets in een totaal van 20 milliliters mannitoloplossing. Meet tot slot, voor deeltjes die zijn geproduceerd via homogenisatie of sonicatie, de grootte van de deeltjes met een zeta sizer en meet de concentratie van de monsters met HPLC.Ter voorbereiding op visualisatie met microscopie worden de bereide nano-art-suspensies 10 seconden lang gesoneerd. Gebruik hiervoor een sonificatieprobe op 20% amplitude. Neem een dekglas voor een microscoopdia en plaats dit op een omgekeerde microscoop. Op het dekglas.Meng 15 µL van de nano art-suspensie met 100 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing en meng door meerdere keren met de pipet op en neer te zuigen. Visualiseer vervolgens de nanodeeltjes met een 20x objectief om de morfologie te bestuderen. Monsters kunnen ook worden voorbereid voor visualisatie met scanning elektronenmicroscopie.Hier zien we beelden verkregen met een A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F laagspannings veldemissie scanning elektronenmicroscoop na isolatie van bloedborne monocyten door centrifugatie, waarbij gezuiverde monocyten in een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter werden toegevoegd aan DMEM aangevuld met de volgende additieven. Zaai vervolgens 2 × 10⁶ cellen per well in six-well platen binnen een bevochtigde atmosfeer, aangevuld met 5% CO₂ en cultiveer deze gedurende zeven dagen om de monocyten te laten differentiëren tot macrofagen voor de analyse van celopname en collectie. Meng nano art met cultuurmedium tot een uiteindelijke concentratie van 100 µM en voeg 1 mL behandelmedium toe aan elke well op het gewenste tijdstip of wanneer de cellen volledig verzadigd zijn met nano art.Verwijder al het behandelmedium en was de cellen drie keer met één milliliter PBS om alle deeltjes die niet door de cellen zijn opgenomen in één milliliter PBS te verwijderen. Verwijder de adherente cellen van de bodem van de well met een cell lifter en plaats deze in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis. Centrifugeer de cellen vervolgens bij 1000 RCF bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Verwijder het supernatant en voeg 200 µL 100% methanol toe om de cellen te lyseren en nano art op te lossen door het pellet kortstondig te sonceren met een sonic probe bij 20% amplitude gedurende twee tot vijf seconden. Bewaar de monsters bij -80 °C tot de analyse van het druggehalte wordt uitgevoerd. De intracellulaire retentie van nano art kan ook worden gevisualiseerd middels transmissie-elektronenmicroscopie nadat de secties zijn geprepareerd met een microtoom, zoals hier te zien is.Raadpleeg de begeleidende tekst bij dit artikel voor details over de analyse van de nano arch release; behandel de cellen zoals eerder beschreven voor de analyse van celopname en collectie. Vervang echter, in plaats van de cellen na het wassen te collecteren, de PBS door twee milliliter celkweekmedium zonder MCSF en zonder nano art op de aangegeven dagen of wanneer het medium geel wordt. Vervang de helft van het medium op de gewenste dag. Collecteer één milliliter van het celmedium samen met replicate cellen en verwerk dit voor analyse van het geneesmiddel.Om de realtime opname te visualiseren met nano art bifocale microscopie, neem eerst een fluorescerende kleurstof zoals Vibrant en voeg deze toe aan het medium. Volg de instructies van de fabrikant, voeg het dye-bevattende medium toe aan de volwassen monocyten-afgeleide macrofagen en spoel de cellen vervolgens drie keer af met één milliliter kweekmedium om overtollige kleurstof te verwijderen. Meng nu nano art met kweekmedium door gebruik te maken van fluorescentielabelled nano art en voeg het behandelmedium met gelabelde nano art toe. Vlak voor de beeldvorming met een confocale microscoop wordt elke 30 seconden een afbeelding vastgelegd gedurende vier uur met een 60x objectief.Ten slotte kunnen assays voor HIV-1 infectie en infectiviteit worden uitgevoerd. Behandel de cellen eerst zoals beschreven voor het visualiseren van de art-afgifte. Verwijder vervolgens op de gewenste dagen al het medium en vervang dit door medium zonder MCSF dat HIV-1 a A bevat bij een multiplicity of infection van 0,01 virale deeltjes per cel, en incubeer dit gedurende 24 uur.Verwijder vervolgens het virale medium en vervang dit door vers virus, en kweek de cellen in mediumvrije cultuur gedurende 10 dagen, waarbij om de dag of naar behoefte de helft van het medium wordt vervangen om de cellen 10 dagen na infectie in leven te houden. Verzamel 10 µL medium uit elke put in een 96-wells plaat en bewaar dit bij -80 °C tot de reverse transcriptase-analyse wordt uitgevoerd. Vervolgens kunnen ook HIV-1 p24-detecties worden uitgevoerd.Hier kunnen we duidelijk de morfologie zien van cellen die zijn blootgesteld aan het virus bij een multipliciteit van infectie van 0,011 een dag na de nano art-behandeling. In deze monocyten-afgeleide macrofagen is er geen bewijs voor virale infectie en de nanodeeltjes zijn duidelijk zichtbaar in het cytoplasma van de cel. Hier werden de cellen 10 dagen na de nano art-behandeling blootgesteld aan het virus.Sommige van deze cellen waren geïnfecteerd, zoals aangetoond door P 24-kleuring en de vorming van meerkernige reuzencellen, maar er was nog steeds sprake van significante bescherming in vergelijking met onbehandelde cellen. Let op dat nanodeeltjes nog steeds zichtbaar zijn in het cytoplasma van cellen in B, maar minder dan in a; deze structuren zijn niet aanwezig in cellen die niet met nano art zijn behandeld. In deze confocale video's van levende cellen zien we macrofagen gelabeld in het groen en nano art gelabeld in het rood.Hier kunnen we zien dat de cellen zeer weinig nanodeeltjes accumuleren. Hier accumuleren ze snel deeltjes, zoals blijkt uit de toegenomen rode fluorescentie. Deze verschillen komen overeen met de bevindingen die worden gezien bij de analyse van de geneesmiddelopname met behulp van HPLC; bovendien kunnen we zien dat de cellen de deeltjes actief opnemen.Het verschil tussen de snelheden van cellulaire accumulatie van nano-kunst weerspiegelt de effecten van fysieke kenmerken zoals grootte, vorm en lading op het vermogen van macrofagen om nano-kunst op te nemen en vast te houden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe nano-kunst kan worden gefabriceerd met behulp van natmaals-homogenisatietechnieken en sonicatie. Dit zijn effectieve methoden voor de productie van antiretrovirale nanodeeltjes.Natmaling en homogenisatie dienen om grotere drugkristalpartikels te fractioneren tot kleinere nanodeeltjes binnen lipide surfactanten, en een sonicatietechniek produceert individuele drugdruppels van nanogrootte binnen een polymeer. Hier hebben we ook gedemonstreerd hoe menselijke monocytafgeleide macrofagen als testplatform kunnen worden gebruikt om transport van nanodeeltjes te beoordelen. Onze testmethode maakt een zeer eenvoudige screening mogelijk van het vermogen van een partikel om door cellen te worden opgenomen, vastgehouden en vrijgegeven, alsofook hun capaciteit om virale replicatie te remmen.Dit stelt de onderzoeker in staat om die nano-kunst te identificeren die de grootste kans op succes in vivo heeft en uiteindelijk kan worden gebruikt bij geïnfecteerde mensen. De volledige resultaten van deze experimenten zijn gepubliceerd in ons artikel Online Nano. Het artikel is getiteld Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics in het Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.Hartelijk dank.

methods-development-for-blood-borne-macrophage-carriage

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

BioImaging methoden die worden gebruikt om cellen biodistributie van nanodeeltjes te beoordelen zijn van toepassing voor therapeutische en diagnostische controle van nanoformulated verbindingen. De werkwijzen die hierin beschreven zijn gevoelig en specifiek wanneer beoordeeld door histologische coregistration. De methodieken voor een translationeel weg van knaagdier voor de menselijke toepassingen.

Geregistreerd BioImaging van nanomaterialen voor diagnostische en therapeutische monitoring

Verschillende 2'-fluor RNA aptameren tegen HIV-1Ba-L gp120 met nanomole affiniteit geïsoleerd zijn van een RNA bibliotheek...

Ontwikkeling van Cell-type-specifieke anti-HIV-gp120 aptameren voor siRNA levering

This video demonstrates an assay to evaluate the effectiveness of oral combined antiretroviral therapy (oral cART) in a human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)-infected humanized mouse model. A combination of drugs targeting HIV-1, including nucleoside reverse transcriptase inhibitors and integrase strand transfer inhibitors, is administered along with a nutritional supplement and antibiotics. Following the consumption of this mixture by the humanized mice infected with HIV-1, the effective...

Oral Combinational Antiretroviral Therapy to Treat HIV-1 Infection in a Humanized Mouse Model

Dit protocol beschrijft de methoden voor het construeren van een gehumaniseerd muismodel voor beenmerg/lever/thymus met stamcelgebaseerde geëngineerde immuniteit tegen HIV-infectie.

Stamcel-Based Engineered immuniteit tegen HIV infectie in het gehumaniseerde muismodel

We beschrijven een methode om de snelheid van fagosomen te meten die zich in levende cellen, geïnfecteerd met of zonder het humaan immunodeficiëntievirus (HIV) type 1, naar het centrum van de cel bewegen, met behulp van spinning disk confocale fluorescentiemicroscopie om gefluorescerende geïnfecteerde cellen te identificeren en helder veld microscopie om fagosomen te detecteren.

Phagosome Migratie en Velocity Gemeten Live primaire humane macrofagen geïnfecteerd met HIV-1

We beschrijven een methode voor de verwerking van bronchoalveolaire spoeling vloeistof en matched perifeer bloed van chronisch HIV-geïnfecteerde individuen op antiretrovirale therapie om pulmonale HIV-reservoirs te beoordelen. Deze methoden resulteren in de verwerving van zeer zuivere CD4 T-cellen en alveolaire macrofagen die vervolgens kunnen worden gebruikt voor immunophenotypering en HIV-DNA/RNA-quantificaties door ultragevoelige polymerase-kettingreactie.

Verwerking van bronchoalveolaire lavage vloeistof en geëvenaard bloed voor alveolaar macrofaag en CD4+ T-cel Immunophenotypering en HIV-reservoir beoordeling

Hier gepresenteerd is een geoptimaliseerd protocol voor het isoleren, kweken, transfecting, en differentiëren menselijke primaire monocyten van HIV-geïnfecteerde individuen en gezonde controles.

Isolatie, transfectie en cultuur van primaire humane monocyten

We hebben een protocol ontwikkeld voor de generatie en evaluatie van een gehumaniseerd en menselijk immunodeficiëntievirus besmet NOG muismodel op basis van stamceltransplantatie, intravaginale blootstelling aan het menselijke immunodeficiëntievirus en druppeldigitale PCR RNA Kwantificering.

Gehumaniseerde NOG Muizen voor intravaginale HIV Blootstelling en behandeling van HIV-infectie

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om orale gecombineerde antiretrovirale geneesmiddelen te leveren die met succes hiv-1-RNA-replicatie bij gehumaniseerde muizen onderdrukken.

Orale gecombineerde antiretrovirale behandeling bij hiv-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen

We demonstreren een stapsgewijs protocol voor het onderzoek naar de genfunctie in macrofagen in peritoneaal weefsel in vivo, met behulp van lentivirale vectoren.

Lentivirale vectorvoorbereiding voor efficiënte gen- en microRNA-modulatie van macrofagen in buikholte in vivo bij muizen

Deze studie gebruikte in-silico-strategieën om Enumerated Etravirine te identificeren als een veelbelovend therapeutisch middel voor HIV. Onze bevindingen over moleculaire interacties en dynamiek ondersteunen het rationele ontwerp van nieuwe NNRTI's als mogelijke alternatieven voor de behandeling van hiv.

Kwantitatieve structuur-activiteitsrelatie, activiteitsvoorspelling en moleculaire dynamiek van niet-nucleotide reverse transcriptaseremmers

Leer de productie en test van nanoART-antiretrovirale nanodeeltjes voor verbeterde celopname en afgifte door macrofagen. Deze methode ondersteunt HIV-therapieonderzoek met verbeterde farmacokinetiek.

Methoden Ontwikkeling voor Blood Borne Macrofaag vervoer van Nanoformulated antiretrovirale geneesmiddelen

Meer video's verkennen