Methoden Ontwikkeling voor Blood Borne Macrofaag vervoer van Nanoformulated antiretrovirale geneesmiddelen

Het doel van deze procedure is het produceren en testen van de cellulaire opname, secretie en antiretrovirale eigenschappen van kristallijne antiretrovirale nanodeeltjes, die wij nano art noemen. Dit wordt bereikt door de antiretrovirale geneesmiddelen eerst te verwerken via sonicatie-homogenisatie of nat malen. De tweede stap van de procedure is het karakteriseren van de fysische eigenschappen van de nano art-deeltjes nadat primaire monocyten zijn geïsoleerd via tegenstroomcentrifugatie.

Ze worden zeven dagen gekweekt in DMEM met macrophage colony stimulating factor, of MCSF, wat hun differentiatie tot monocyten-afgeleide macrofagen induceert. De derde stap is het testen van de opname, retentie en afgifte van nano art in menselijke monocyten-afgeleide macrofagen. De laatste stap van de procedure is het testen van de in vitro antiretrovirale werkzaamheid van nano art in monocyten-afgeleide macrofagen.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de vergemakkelijkte opname en langzame afgifte van nano-art uit cellen en een robuuste antiretrovirale werkzaamheid aantonen. Deze worden bepaald door metingen van drugspiegels via hogedrukvloeistofchromatografie of HPLC en door het testen van geïnfecteerde cultuursuprenanten door middel van de meting van de reverse transcriptase-activiteit. Hallo, ik ben Hanta Aldi en ik ben postdoctoraal onderzoeker in het laboratorium van Dr. Howard Gelman aan het University of Nebraska Medical Center.

De methoden die we presenteren kunnen helpen bij het beantwoorden van kernvragen in de nanomedicijnleer, waaronder hoe celgebaseerde systemen voor geneesmiddelentoediening kunnen worden ingezet om translationele onderzoeksactiviteiten te ontwikkelen. Dit kan worden bereikt door het gebruik van nano-geformuleerde antiretrovirale therapie met verlengde halfwaardetijden. Onze studies ondersteunenHet potentieel van nano-art voor klinisch gebruik.

Hoi, mijn naam is Ari Noche en ik ben een MD-PhD-student onderzoeker werkzaam in het Carol Schwartz Emerging Neuroscience Laboratory. Onder begeleiding van Dr. Gendelman reiken de implicaties van de technieken die wij hier laten zien tot antiretrovirale therapie, aangezien nano-geformuleerde verbindingen gelijktijdig de biologische beschikbaarheid en farmacokinetiek kunnen verbeteren, terwijl ze tegelijkertijd medicijngerelateerde bijwerkingen verminderen. Door klinisch beschikbare antiretrovirale medicatie te nemen en deze opnieuw te verpakken in nanodeeltjes, kunnen we mogelijk de therapietrouw verbeteren en een positief effect hebben op de ziekteuitkomsten.

Hallo, ik ben Dr. Howard Gendelman. Ik ben klinisch wetenschapper en professor en hoofd van de afdeling Farmacologie en Experimentele Neurowetenschappen hier aan het University of Nebraska Medical Center. Ons algemene doel is om antiretrovirale geneesmiddelen te vereenvoudigen om ze gemakkelijker beschikbaar te maken en de biodistributie en farmacokinetiek te verbeteren.

Ik geef nu het woord aan Ari en Sean, die u meenemen naar het onderzoekslaboratorium om te laten zien hoe de productie en ontwikkeling van deze nanodeeltjes worden uitgevoerd. Klinisch nut en ontwikkeling hier aan het University of Nebraska Medical Center. Om nano-art te produceren via nat malen: weeg eerst de geneesmiddelkristallen en de diverse surfactanten die worden gebruikt voor de nano-formuleringen en meng deze met 10 millimolar heis-buffer pH 7.8. Gebruik hiervoor een T 18 ultra Turx-mixer totdat alles volledig is gedispergeerd; het percentage van het geneesmiddel in de formulering moet tussen 1% en 2% liggen voor continu malen.

Zorg ervoor dat de koeler en de compressor zijn ingeschakeld en dat de uitlaatdruk nu rond de 100 PSI ligt; stel het systeem vervolgens zo in dat het maalsmedium in de tank kan worden geladen en voeg 50 milliliters kralen toe aan de maalkamer. Gebruik een trechter en controleer of er geen kralen in de schroefdraad of elders buiten de maalkamer zitten om lekken in de mechanische afdichting te voorkomen. Controleer nu of de O-ring correct op zijn plaats zit in de maalkamer.

Select vervolgens een geschikte maaswijdte voor het zeefgaas en bevestig de deksels door de moeren aan te draaien. De maaswijdte moet ten minste de helft van de grootte van de kralen bedragen. Gebruik een grote maaswijdte om te voorkomen dat het product het filter verstopt tijdens het continue malen.

Nadat de maalkamer is neergelaten, voegt u de drug-suspensie met verschillende hoeveelheden surfactant toe aan de productinlaat. Het minimale volume van de suspensie moet 100 milliliters zijn. Dit voorkomt oververhitting van de maalkamer en vermindert bead-contaminatie door minder slijtage van de onderdelen.

Start vervolgens de pomp. Gebruik de besturingseenheid om de stroomsnelheid aan te passen aan uw formulering. Zet daarna de roerder aan en stel de snelheid in op de besturingseenheid.

De snelheid kan worden verhoogd van 600 omwentelingen per minuut tot 4.320 omwentelingen per minuut. Controleer bij een micro sur de temperatuur met de temperatuurmeter die bovenop de maalchamber is bevestigd om oververhitting te voorkomen. Maal het monster nu op verschillende snelheden en stroomsnelheden en neem kleine aliquots van ongeveer één milliliter van de formulering af voor grootte- en ladingsmetingen met behulp van een diffractie-lichtverstrooiings malvern zeta sizer.

Zodra de gewenste grootte is bereikt, stopt u het malen via de bedieningseenheid en verzamelt u, terwijl de pomp nog aan staat, het monster in een fles, waarbij u het geneesmiddel volledig laat weglopen. Vergeet niet de pomp uit te schakelen wanneer u klaar bent, en verwijder en reinig de mallinkogels. Breng nu de malingsuspensie over in centrifugebuisjes van 50 milliliter en stel de centrifuge in op 10.000 toeren per minuut voor 30 minuten.

Nadat de centrifugecyclus is voltooid, meet u de hoeveelheid bovenzit en vervangt u deze door dezelfde hoeveelheid verse surfactantoplossing. Zodra de resuspensie voltooid is, brengt u de suspensie over naar de maalkamer en maalt u deze gedurende 10 minuten. Neem een aliquot van ongeveer één milliliter en meet de grootte en lading van de monster opnieuw met de Zeta sizer.

Meet ten slotte de concentratie van de nano-art formuleringen met behulp van HBLC om nano-art te produceren via homogenisatie. Bereid met de Avastin Emulex C five de drugkristallen en diverse surfactanten voor zoals eerder beschreven, breng de suspensie over naar het homogenisatievat en start de recirculatie. Zorg ervoor dat de chiller is ingeschakeld voordat u begint met het homogeniseren van het monster.

Verhoog de druk geleidelijk totdat de meter 20.000 ± 2000 PSI aangeeft en homogeniseer verder tot de doelpartikelgrootte is bereikt. Dit duurt gewoonlijk tussen de 45 en 60 minuten. Neem periodiek een aliquot van ongeveer één milliliter en meet de grootte en lading van de monstername van de gehomogeniseerde suspensie met een zeta sizer centrifuge, zoals eerder beschreven.

Overbreng na de Resus-suspensie de suspensie naar de C five homogenisator. Start de circulatie opnieuw op en breng de homogenisatiedruk terug naar 20.000 plus of minus 2000 PSI en homogeniseer gedurende 30 minuten om te vervaardigen via sonicatie met behulp van de cold Palmer ultrasone processor. Giet de chloormethaan PLGA- en geneesmiddeloplossing in een 1% PVA-surfactantoplossing en plaats deze in een ijsbad in de ultrasoon.

Start de sonicatie bij 50% amplitude, hoewel de amplitude van de sonicatie kan worden verlaagd naar ongeveer 30% amplitude voor kleinere monsterbatches; soniceer het monster gedurende 10 minuten. Neem een klein aliquot af voor de analyse van de partikelgrootte. Indien de partikelgrootte groter is dan 1,5 micron, soniceer de monsters dan in intervallen van twee minuten tot een maximum van 16 minuten in totaal.

Observeer de monsters onder de microscoop bij een 20-voudige vergroting en documenteer de waarnemingen. Gebruik een roerplaat om een adequate vortex voor de suspensie te creëren en meng deze gedurende de nacht bij kamertemperatuur verder. Verzamel de suspensie na 24 uur en giet deze over in centrifugebuizen van 50 milliliter.

Centrifugeer de monsters bij een snelheid van 8.000 toeren per minuut gedurende 20 minuten bij 5 °C, decanteer het supernatant en resuspendeer de ene helft van het monster in 75 milliliters gefiltreerd omgekeerd osmosewater en de andere helft in 75 milliliters 0,5% CTAB trimethylammoniumbromide surfactant. Centrifugeer de monsters opnieuw bij een snelheid van 8.000 toeren per minuut gedurende 20 minuten bij 5 °C en resuspendeer elk van de pellets in een totaal van 20 milliliters mannitoloplossing. Meet tot slot, voor deeltjes die zijn geproduceerd via homogenisatie of sonicatie, de grootte van de deeltjes met een zeta sizer en meet de concentratie van de monsters met HPLC.

Ter voorbereiding op visualisatie met microscopie worden de bereide nano-art-suspensies 10 seconden lang gesoneerd. Gebruik hiervoor een sonificatieprobe op 20% amplitude. Neem een dekglas voor een microscoopdia en plaats dit op een omgekeerde microscoop. Op het dekglas.

Meng 15 µL van de nano art-suspensie met 100 µL fosfaatgebufferde zoutoplossing en meng door meerdere keren met de pipet op en neer te zuigen. Visualiseer vervolgens de nanodeeltjes met een 20x objectief om de morfologie te bestuderen. Monsters kunnen ook worden voorbereid voor visualisatie met scanning elektronenmicroscopie.

Hier zien we beelden verkregen met een A-J-E-O-L Jsm 6 3 0 0 F laagspannings veldemissie scanning elektronenmicroscoop na isolatie van bloedborne monocyten door centrifugatie, waarbij gezuiverde monocyten in een concentratie van 1 × 10⁶ cellen per milliliter werden toegevoegd aan DMEM aangevuld met de volgende additieven. Zaai vervolgens 2 × 10⁶ cellen per well in six-well platen binnen een bevochtigde atmosfeer, aangevuld met 5% CO₂ en cultiveer deze gedurende zeven dagen om de monocyten te laten differentiëren tot macrofagen voor de analyse van celopname en collectie. Meng nano art met cultuurmedium tot een uiteindelijke concentratie van 100 µM en voeg 1 mL behandelmedium toe aan elke well op het gewenste tijdstip of wanneer de cellen volledig verzadigd zijn met nano art.

Verwijder al het behandelmedium en was de cellen drie keer met één milliliter PBS om alle deeltjes die niet door de cellen zijn opgenomen in één milliliter PBS te verwijderen. Verwijder de adherente cellen van de bodem van de well met een cell lifter en plaats deze in een 1,7 milliliter microcentrifugebuis. Centrifugeer de cellen vervolgens bij 1000 RCF bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Verwijder het supernatant en voeg 200 µL 100% methanol toe om de cellen te lyseren en nano art op te lossen door het pellet kortstondig te sonceren met een sonic probe bij 20% amplitude gedurende twee tot vijf seconden. Bewaar de monsters bij -80 °C tot de analyse van het druggehalte wordt uitgevoerd. De intracellulaire retentie van nano art kan ook worden gevisualiseerd middels transmissie-elektronenmicroscopie nadat de secties zijn geprepareerd met een microtoom, zoals hier te zien is.

Raadpleeg de begeleidende tekst bij dit artikel voor details over de analyse van de nano arch release; behandel de cellen zoals eerder beschreven voor de analyse van celopname en collectie. Vervang echter, in plaats van de cellen na het wassen te collecteren, de PBS door twee milliliter celkweekmedium zonder MCSF en zonder nano art op de aangegeven dagen of wanneer het medium geel wordt. Vervang de helft van het medium op de gewenste dag. Collecteer één milliliter van het celmedium samen met replicate cellen en verwerk dit voor analyse van het geneesmiddel.

Om de realtime opname te visualiseren met nano art bifocale microscopie, neem eerst een fluorescerende kleurstof zoals Vibrant en voeg deze toe aan het medium. Volg de instructies van de fabrikant, voeg het dye-bevattende medium toe aan de volwassen monocyten-afgeleide macrofagen en spoel de cellen vervolgens drie keer af met één milliliter kweekmedium om overtollige kleurstof te verwijderen. Meng nu nano art met kweekmedium door gebruik te maken van fluorescentielabelled nano art en voeg het behandelmedium met gelabelde nano art toe. Vlak voor de beeldvorming met een confocale microscoop wordt elke 30 seconden een afbeelding vastgelegd gedurende vier uur met een 60x objectief.

Ten slotte kunnen assays voor HIV-1 infectie en infectiviteit worden uitgevoerd. Behandel de cellen eerst zoals beschreven voor het visualiseren van de art-afgifte. Verwijder vervolgens op de gewenste dagen al het medium en vervang dit door medium zonder MCSF dat HIV-1 a A bevat bij een multiplicity of infection van 0,01 virale deeltjes per cel, en incubeer dit gedurende 24 uur.

Verwijder vervolgens het virale medium en vervang dit door vers virus, en kweek de cellen in mediumvrije cultuur gedurende 10 dagen, waarbij om de dag of naar behoefte de helft van het medium wordt vervangen om de cellen 10 dagen na infectie in leven te houden. Verzamel 10 µL medium uit elke put in een 96-wells plaat en bewaar dit bij -80 °C tot de reverse transcriptase-analyse wordt uitgevoerd. Vervolgens kunnen ook HIV-1 p24-detecties worden uitgevoerd.

Hier kunnen we duidelijk de morfologie zien van cellen die zijn blootgesteld aan het virus bij een multipliciteit van infectie van 0,011 een dag na de nano art-behandeling. In deze monocyten-afgeleide macrofagen is er geen bewijs voor virale infectie en de nanodeeltjes zijn duidelijk zichtbaar in het cytoplasma van de cel. Hier werden de cellen 10 dagen na de nano art-behandeling blootgesteld aan het virus.

Sommige van deze cellen waren geïnfecteerd, zoals aangetoond door P 24-kleuring en de vorming van meerkernige reuzencellen, maar er was nog steeds sprake van significante bescherming in vergelijking met onbehandelde cellen. Let op dat nanodeeltjes nog steeds zichtbaar zijn in het cytoplasma van cellen in B, maar minder dan in a; deze structuren zijn niet aanwezig in cellen die niet met nano art zijn behandeld. In deze confocale video's van levende cellen zien we macrofagen gelabeld in het groen en nano art gelabeld in het rood.

Hier kunnen we zien dat de cellen zeer weinig nanodeeltjes accumuleren. Hier accumuleren ze snel deeltjes, zoals blijkt uit de toegenomen rode fluorescentie. Deze verschillen komen overeen met de bevindingen die worden gezien bij de analyse van de geneesmiddelopname met behulp van HPLC; bovendien kunnen we zien dat de cellen de deeltjes actief opnemen.

Het verschil tussen de snelheden van cellulaire accumulatie van nano-kunst weerspiegelt de effecten van fysieke kenmerken zoals grootte, vorm en lading op het vermogen van macrofagen om nano-kunst op te nemen en vast te houden. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe nano-kunst kan worden gefabriceerd met behulp van natmaals-homogenisatietechnieken en sonicatie. Dit zijn effectieve methoden voor de productie van antiretrovirale nanodeeltjes.

Natmaling en homogenisatie dienen om grotere drugkristalpartikels te fractioneren tot kleinere nanodeeltjes binnen lipide surfactanten, en een sonicatietechniek produceert individuele drugdruppels van nanogrootte binnen een polymeer. Hier hebben we ook gedemonstreerd hoe menselijke monocytafgeleide macrofagen als testplatform kunnen worden gebruikt om transport van nanodeeltjes te beoordelen. Onze testmethode maakt een zeer eenvoudige screening mogelijk van het vermogen van een partikel om door cellen te worden opgenomen, vastgehouden en vrijgegeven, alsofook hun capaciteit om virale replicatie te remmen.

Dit stelt de onderzoeker in staat om die nano-kunst te identificeren die de grootste kans op succes in vivo heeft en uiteindelijk kan worden gebruikt bij geïnfecteerde mensen. De volledige resultaten van deze experimenten zijn gepubliceerd in ons artikel Online Nano. Het artikel is getiteld Nano Formulated Antiretroviral Drug Combinations Extend Drug Release and Antiretroviral Responses in HIV V one Infected Macrophages, implications for Neuro AIDS Therapeutics in het Journal of Neuro Immune Pharmacology 2010.

Hartelijk dank.