JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:40 min • August 31st, 2026
Neem culturen van borstkankercellen.
Coinfecteer met twee typen adenovirussen. Eén hiervan draagt een gen voor groen fluorescent eiwit of GFP onder een constitutief actieve promoter.
De andere bevat een reportergen dat codeert voor rood fluorescent eiwit of RFP, onder een SMAD-responsieve promotor.
Voeg TGF-beta toe aan de testkweek en incubeer deze.
De virussen binden aan de receptor om de gastheercel binnen te dringen, brengen de genen in de kern over en maken de expressie van GFP mogelijk.
In testcellen bindt TGF-beta aan zijn receptor en activeert het de SMAD-route door de eiwitten SMAD2 en SMAD3 te fosforyleren.
Deze eiwitten vormen een complex met SMAD4.
Dit complex bindt aan de promotor van het reportergen, waardoor RFP-expressie mogelijk wordt naast GFP.
In de controle blijft de SMAD-route inactief, waardoor de cellen alleen GFP tot expressie brengen.
Maak fluorescentiebeelden van levende cellen.
De aanwezigheid van beide signalen bevestigt de activering van de SMAD-route middels dubbele adenovirus-transductie.
Zaai op de dag van de adenoviraal infectie de putjes van een 12-wells plaat met ongeveer 1,25 x 10⁵ MDA-MB-231 cellen in 500 µL medium voor een confluentie van 35%. Infecteer de cellen in alle putjes met 75 µL adenovirus-CMV-GFP en 7,5 µL adenovirus CAGA12-Td-Tomato om een MOI van 2.500 te verkrijgen, waarmee een infectiepositiviteit van 100% kan worden bereikt. Voeg vervolgens direct na de adenoviraal infectie TGF-β toe aan het behandelputje.
Incubeer bij 37 °C met 10% CO2 gedurende 24 uur. Beeld de volgende dag de levende cellen af met een fasecontrast-fluorescentiemicroscoop.