JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 2:36 min. • August 31st, 2026
Begin met humane lymfocyten geïnfecteerd met HIV-1 op een dekglas dat op een objectglas is gemonteerd.
Deze cellen zijn gehybridiseerd met probes die viraal RNA en proviraal DNA fluorescent labelen.
Incubeer de cellen in een blokkeringsoplossing om aspecifieke antilichaambinding te voorkomen.
Voeg primaire antilichamen toe die gericht zijn tegen het HIV-1 capsid-eiwit.
Incubeer om de primaire antilichamen te laten binden aan het capside-eiwit.
Was de cellen met buffer om ongebonden antilichamen te verwijderen.
Voeg fluorescentielabelige secundaire antilichamen toe die binden aan de primaire antilichamen.
Was de niet-gebonden antilichamen weg.
Voeg een DNA-specifieke kleurstof toe om de celkernen te kleuren en was vervolgens om overtollige kleurstof te verwijderen.
Gebruik multiplexe fluorescentie-imaging om gelijktijdig viraal DNA, RNA, proteïnen en gastheerkernen in verschillende kleuren te detecteren.
Deze visualisatie op enkelcelniveau maakt het mogelijk om verschillende stadia van de virale levenscyclus te bestuderen door gelijktijdige visualisatie van viraal DNA, RNA en eiwitten in geïnfecteerde cellen.
Voor de immunostaining van de proteïnen van belang wordt elk dekglas na de laatste wasbeurt behandeld met 200 microliter blokkeringsbuffer gedurende een incubatie van één uur bij kamertemperatuur.
Giet aan het einde van de incubatie de blokkeringsbuffer af en voeg 200 microliter van het gewenste primaire antilichaam toe, verdund in PBS plus Tween 20 aangevuld met 1% bovine serum albumin. Na een incubatie van één uur bij kamertemperatuur worden de coupes gewassen met twee wasbeurten van 10 minuten in verse PBS plus Tween 20 met schudden per wasbeurt, alvorens de monsters gedurende één uur bij kamertemperatuur te labelen met een passend secundair antilichaam. Giet aan het einde van de incubatie de slides twee keer af met verse PBS plus Tween 20 gedurende 10 minuten met schudden per wasbeurt.
Na de tweede wasstap worden de kernen gedurende één minuut bij kamertemperatuur tegengekleurd met een geschikte kernkleurstof, gevolgd door twee wasbeurten in PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur onder schudding.