Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Het algemene doel van deze procedure is om cellulase-expresserende klonen uit een metagenomische bibliotheek te identificeren. Dit wordt bereikt door eerst een eerder gemaakte metagenomische bibliotheek te repliceren met behulp van een robot na incubatie van de gerepliceerde bibliotheek bij 37 graden Celsius gedurende 24 uur. De groei van de e coli-klonen wordt gemeten, waarna lysis, buffer en substraat aan de gerepliceerde bibliotheek wordt toegevoegd.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die cellulase-activiteit laten zien door middel van colormetrische absorptiemetingen met behulp van een plate reader. Hoi, ik ben Keith van het laboratorium van Steven Hallam in het Department of Microbiology and Immunology aan de University of British Columbia. Vandaag laten we u een procedure zien voor de hoogwaardige functionele screening van metagenomische bibliotheken.

We gebruiken deze procedure in ons laboratorium om biomin cellulase-activiteit van metagenomische bibliotheken te bestuderen. Dus laten we beginnen. Voordat u begint met dit protocol, bereidt u een metagenomische bibliotheek voor die is opgeslagen in een 384-well plate-indeling.

Deze studie gebruikte de PCC one copy control SMID-vector in combinatie met Farge T one resistente TRANSFECT max EPI 300 T one resistente e coli-cellen als de bibliotheekhost om deze procedure te starten, verwijder de platen met de bibliotheek uit min 80 graden Celsius en ontdooi ze gedurende ongeveer 20 minuten bij 37 graden Celsius. Gebruik ondertussen de UV-licht sterilisatiefunctie op de QIX twee om de robot gedurende 15 minuten te steriliseren. Zet de Q fill drie op volgens de instructies van de fabrikant met de mediafles die via de steriele slangenset aan de manifold is bevestigd.

De Q fill drie voor de juiste hoeveelheid media en stel het in om een volume van 45 microliter te vullen. In elke well, verwijder de lucht uit de slangen en de manifold met behulp van de purge-functie van de robot totdat media zichtbaar is. Vul bij elke pin van de manifold het gewenste aantal platen met LB-media met behulp van de Q fill drie.

Elke plaat duurt ongeveer 20 seconden om te vullen. Laad vervolgens de bibliotheekplaten en de verse platen in de juiste gebieden van de Q picks. Laat de robot de reinigingsbaden vullen met de juiste reagentia.

2% micro 90 in het achterste bad, geautoclaveerd gedistilleerd water in het middelste bad en 80% ethanol in het voorste bad. Gebruik het replicatieprogramma van de qix twee, selecteer het juiste hoofd evenals het aantal en de typen van zowel bron- als bestemmingsplaten. Stel ook het hoofd in om te reinigen tussen replicaties.

Meestal is zes cycli in elk bad voldoende. De capaciteit van de machine is 10 platen tegelijk. Zet de machine aan.

Het zal ongeveer 15 minuten duren om het te repliceren. Volle capaciteit met een 384-pin hoofd. Zodra de platen zijn gerepliceerd, kweek de platen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een vochtigheidskast.

De lange incubatietijd is noodzakelijk omdat een hoog aantal SMID wordt geïnduceerd met de toevoeging van arabinose. Ondertussen, reinig de Q fill drie robot zoals beschreven in het geschreven protocol. Verwijder na incubatie de platen uit de 37 graden Celsius incubator.

Leg de deksels opzij en plaats de platen op de magazine laadplatform die wordt geleverd met de snelle stapel. Zorg ervoor dat u de volgorde van de platen bijhoudt, omdat de software dat niet doet. De platen aan de onderkant van de stapel worden gelezen.

Verwijder eerst een magazine uit de snelle stapel. Zorg ervoor dat het leeg is en duw het op de stapel platen die gelezen moeten worden. Pak het magazine bij de handgreep en de plaat moet in het magazine laden.

Laad het magazine in de snelle stapel in de juiste oriëntatie. Open het scan its re programma op de aangesloten computer. Selecteer nieuwe sessie en geef het een passende naam.

Kies calling flat bottom 384 Well plate als de plaat. Typ in het plaatlay-outgebied. Selecteer de wizard-knop en kies deze om 384 onbekenden toe te voegen aan de plaat.

Selecteer in het protocolgebied de well loop-optie en voer in voor 384 wells. Er verschijnt een well loop-pictogram in de stroomboom aan de linkerkant van het scherm. Selecteer het pictogram en klik om fotometrische meting toe te voegen.

Stel het in om te lezen bij 600 nanometer. Sla het protocol op met een unieke naam en sluit het scan its re programma. Open vervolgens het polara RS programma.

Op de hoofdpagina staat een tabel met de instrumenten die zijn aangesloten op het snelle stapelapparaat onder de VARI scan-kop, klik op de sessie uitvoeren optie. Het assay-venster zou dan moeten verschijnen met een stroomdiagram in het midden. Selecteer het sessie uitvoeren item, zoek vervolgens de naam van het opgeslagen scan.

Het re run in het vervolgkeuzemenu dat verschijnt aan de rechterkant van het scherm. Zodra het protocol is geselecteerd, klik op uitvoeren. Deze assay-box zal verschijnen en vragen welke magazine te gebruiken als de bron en welke magazine leeg is.

Het onderste vak op het scherm komt overeen met het voorste magazine zine. Zorg ervoor dat zowel de snelle stapel als de Vario scan zijn ingeschakeld en klik op start. De snelle stapel zal de platen automatisch laden in de plate reader, wat continu metingen van de platen mogelijk maakt.

Observeer de eerste plaat die in de Vario scan wordt geladen om ervoor te zorgen dat de machines correct zijn uitgelijnd om te lezen. 25 platen duurt ongeveer 50 minuten. Zodra Barrios scan klaar is, verwijder de volledige magazine en plaats deze op de magazine laadplatform.

Til het buitenste rechthoekige platform op en het magazine zou eruit glijden, waarbij de platen in een stapel in het midden achterblijven. Vervolgens, plaats de deksels op de platen voor een oplossingsgebaseerde screening. Voor cellulose-activiteit, bereid eerst het assay-mengsel met behulp van een vooraf gemaakte 10 keer stock van lysis.

Meng in 50 millimolair kaliumacetaatbuffer bij pH 5,5 zoals beschreven in het geschreven protocol. Bereid vervolgens een stock van maximaal 75 milligram per milliliter, chromogeen