Name: Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Leer een high-throughput screening voor cellulase-activiteit uit metagenomische bibliotheken in Escherichia coli. Deze methode identificeert enzym-expressie via geautomatiseerde kleurmetingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Steve Withers en Hong-Ming Chen bedanken voor het verstrekken van DNP-Cellobioside substraat.

Vóór het begin van dit protocol, moet u uw metagenomic bibliotheek die is opgeslagen in een 384 wells plaat-formaat. In ons onderzoek gebruikten we de pCC1 kopie controle fosmid vector in combinatie met faag T1-resistente TransforMax EPI300-T1 R E. coli-cellen als de bibliotheek gastheer en opgeslagen onze borden bij -80 ° C 11. 1. Replicatie van de Metagenomic Bibliotheek Platen <ol><li> Ontdooi de platen met uw bibliotheek bij 37 ° C gedurende ongeveer 20 minuten, of totdat alle putten zijn ontdooid. </li><li> Gebruik het UV-licht steriliseren-functie op de qPix2 om de robot te steriliseren gedurende 15 minuten. </li><li> Bereid LB bouillon met chlooramfenicol bij een uiteindelijke concentratie van 12.5ug/mL en arabinose op 100ug/mL in een 500ml fles reagens. Elke plaat zal gebruik maken van ongeveer 20 ml, plus een aanvullend 50ml toe te staan ​​voor de dood volume. </li><li> Stel de qFill3 als instructies per fabrikant met de media fles bevestigd aan het spruitstuk via de steriele slang. Programma is voor de juiste hoeveelheid media, en stel deze in een 45uL volume in elk putje te vullen. </li><li> Spoel de lucht uit de slang en veelvuldige gebruik van de zuivering functie van de robot tot de media zichtbaar is vanuit elke pin van het spruitstuk. </li><li> Vul het gewenste aantal platen met LB media met behulp van de qFill3. Elke plaat duurt ongeveer 20 seconden in te vullen. </li><li> Laad de bibliotheek platen en de verse platen in de juiste gebieden van de qPix2 robot. Vul het reinigen van baden met de juiste reagentia; 2% Micro90 in het achterste bad, geautoclaveerd gedestilleerd water in het midden bad, 80% ethanol in de voorste bad. </li><li> Gebruik de "Kopiëren" programma van de qPix2. In de software, selecteert u de juiste kop, het aantal en de aard van de bron en de bestemming platen platen. Ook het opzetten van de kop tussen replicaties, meestal 6 cycli schoon in elk bad is genoeg. Capaciteit van de machine is 10 platen per keer, en het duurt ongeveer 15 minuten om ze allemaal te repliceren met een 384 pin hoofd (of ongeveer 50 minuten met een 96 pin hoofd). Opmerking: Er is een optie om "Stir Source" of "Roer Destination". Het is aanbevolen om geen gebruik van de opties, problemen hebben eerder opgetreden met onze robot het gebruik ervan. </li><li> Zodra de platen worden gerepliceerd, groeien de platen bij 37 ° C gedurende 24 uur in een vochtige doos. Omdat we het induceren van een groot aantal kopieën van fosmid met toevoeging van arabinose, de klonen hebben de neiging om te groeien langzamer dan niet-geïnduceerde klonen. Terug te keren in de bibliotheek platen tot -80 ° C. Let op: Incubatie in een doos luchtvochtigheid zorgt voor verdamping van de media niet voorkomt in de putjes op de rand van de platen, het bijhouden van een uniforme omgeving voor alle putten. </li><li> Reinig de qFill3 robot door eerst spoelen met water (~ 50 ml) en daarna 80% ethanol (~ 50 ml). Demonteer de onderdelen, en schoon en autoclaaf de fles, deksel, en slangen gewikkeld in aluminiumfolie. </li></ol> 2. Het meten van de groei van E. coli Clones <ol><li> Verwijder de platen van 37 ° C incubator. Verwijder en vernietiging van het deksels, borden en leg op het magazine laadvloer voorzien van de RapidStak, tot een maximum van 25 platen. Opmerking: De plaat aan de onderkant van de stapel zal de eerste zijn die te lezen zijn. Zorg ervoor dat bij te houden van de orde van de platen, omdat de software niet te nemen dit. </li><li> Verwijder een magazine van de Rapid Stak, zorg dan dat leeg is, en druk het op de stapel borden te lezen. Pak hem bij het handvat, en de platen moeten allemaal worden geladen in het magazijn. Laad het magazijn in de RapidStak. Opmerking: Het tijdschrift heeft een kleine schroef in de hoek aangeeft welke hoek de A1 putten van de platen moeten gaan. Het magazine zal alleen monteren in de RapidStak in een richting. </li><li> Open het SkanIt RE programma op de computer is aangesloten op de machines. Selecteer "New Session" een toepasselijke naam. Kies "Corning Flat Bottom 384-wells plaat", zoals de plaat type. </li><li> In het "Plate Layout", selecteert u de "Wizard" knop, en kies het naar 384 onbekenden toe te voegen aan uw bord. </li><li> In het "Protocol", selecteert u de "Nou Loop" optie, en voer voor 384 bronnen. Een "Nou Loop" icoon zal verschijnen in de flow-boom aan de linkerkant van het scherm. Selecteert u het pictogram en klik toe te voegen "Fotometrische meten". Stel het te lezen op 600 Nm. </li><li> Sla uw protocol met een unieke naam, en sluit het SkanIt RE-programma. </li><li> Op de computer, opent u de PolaraRS programma. </li><li> Op de hoofdpagina zal er tabel met de instrumenten aangesloten op het RapidStak apparaat. De VarioSkan moet zich aan de linkerkant van deze tabel. Onder de VarioSkan kop, zullen er twee links: "RunSession" en "Incubate". Klik op de "RunSession" optie. </li><li> Wordt een nieuw venster, de test venster, zal verschijnen met een stroomdiagram in het midden. Selecteer de "RunSession" item (het zou het enige punt aanwezig te zijn). Aan de rechterkant van het scherm een ​​drop-down menuzal verschijnen. Zoek de naam van uw opgeslagen SkanIt RE lopen in dit menu. Let op: Er lijkt geen enkele rationele bestellen om dit menu. Het is niet alfabetisch, of op datum toegevoegd, of verband houden met waar op de computer het protocol wordt opgeslagen. Dit betekent dat je moet kijken door alle protocollen voor het vinden van uw eigen, wat een pijn. </li><li> Als je eenmaal hebt gekozen uw protocol, in de rechterbovenhoek klikt u op "Uitvoeren deze test". </li><li> Een box zal verschijnen, waarin u wordt gevraagd aan te geven welk tijdschrift te gebruiken als de bron, en die het tijdschrift is leeg. Het onderste vak op het scherm komt overeen met de voorkant magazine. [Optioneel: Het vraagt ​​u om het aantal platen geladen naar een schatting voor de hoeveelheid tijd die nodig is vast te stellen. Deze schatting is normaal gesproken weg.] </li><li> Zorg ervoor dat zowel de RapidStak en de VarioSkan zijn ingeschakeld, en druk op "OK". </li><li> De RapidStak zal automatisch laad je platen in de plaat lezer, maakt de continue metingen van platen. Voor het lezen van 25 platen duurt ongeveer 50 minuten. Opmerking: Het is aanbevolen om de eerste plaat in acht laden in de VarioSkan om een ​​goede uitlijning van de machines te verzekeren. Als de RapidStak niet wordt geladen de plaat lezer goed gebruik maken van de "Pauze deze test" knop in de rechterbovenhoek van het PolaraRS venster. </li><li> Zodra de VarioSkan is gedaan het lezen van alle borden, verwijder de volledige blad en plaats het op het tijdschrift laadvloer. Til de buitenste rechthoek van het platform, en het tijdschrift zou moeten glijden, waardoor de platen staan ​​in een stapel in het midden. Plaats de deksels op de juiste platen. </li></ol> 3. Toevoeging van de Assay Mix op elk bord <ol><li> Bereid test mix met behulp van kant en klare 10x voorraad van lysis mix (10% Triton X-100, 100mm ris, 10 mM EDTA) in 50 mM kaliumacetaat buffer bij pH 5,5. Bereid een voorraad van maximaal 75mg/mL DNP-cellobioside substraat in DMSO, zorg ervoor dat de ondergrond volledig is opgelost. Voeg DNP-cellobioside stockoplossing aan assay mengen tot een uiteindelijke concentratie van 0.1mg/mL. Elke plaat zal gebruik maken van ongeveer 20 ml van de oplossing, plus een aanvullend 50ml toe te staan ​​voor de dood volume. Let op: DNP-Cellobioside is niet gemakkelijk oplosbaar in water, dus oplossen in DMSO verhoogt de oplosbaarheid. De aanwezigheid van DMSO in de uiteindelijke analyse-oplossing heeft geen waarneembare effecten. </li><li> Stel de qFill3 als instructies per fabrikant met de media fles bevestigd aan het spruitstuk via de steriele slang. Programma is voor de juiste hoeveelheid media, en stel deze in een 45uL volume in elk putje te vullen. </li><li> Spoel de lucht uit de slang en veelvuldige gebruik van de zuivering functie van de robot tot de media zichtbaar is vanuit elke pin van het spruitstuk. </li><li> Voeg assay mix om elke plaat met behulp van de qFill3. Elke plaat duurt ongeveer 20 seconden in te vullen. </li><li> Zodra test mix is ​​toegevoegd, Incubeer de platen bij 37 ° C in een luchtvochtigheid box voor 12-16 uur. Let op: Over-incubatie van platen als de test mix wordt toegevoegd zal verdamping veroorzaken in de buitenste putjes van de plaat, waardoor een hogere absorptie metingen dan gezien wordt voor de binnenkant putten. Dit kan worden gecompenseerd door incuberen platen in een vochtige kamer. </li></ol> 4. Het lezen van absorptie van getest Clones <ol><li> Verwijder de platen van 37 ° C incubator. Verwijder en vernietiging van het deksels, borden en leg op het magazine laadvloer voorzien van de RapidStak, tot een maximum van 25 platen. Opmerking: De plaat aan de onderkant van de stapel zal de eerste zijn die te lezen zijn. Zorg ervoor dat bij te houden van de orde van de platen, omdat de software niet te nemen dit. </li><li> Verwijder een magazine van de Rapid Stak, zorg dan dat leeg is, en druk het op de stapel borden te lezen. Pak hem bij het handvat, en de platen moeten allemaal worden geladen in het magazijn. Laad het magazijn in de RapidStak. Opmerking: Het tijdschrift heeft een kleine schroef in de hoek aangeeft welke hoek de A1 putten van de platen moeten gaan. Het magazine zal alleen monteren in de RapidStak in een richting. </li><li> Open het SkanIt RE programma op de computer is aangesloten op de machines. Selecteer "New Session" een toepasselijke naam. Kies "Corning Flat Bottom 384-wells plaat", zoals de plaat type. </li><li> In het "Plate Layout", selecteert u de "Wizard" knop, en kies het naar 384 onbekenden toe te voegen aan uw bord. </li><li> In het "Protocol", selecteert u de "Nou Loop" optie, en voer voor 384 bronnen. Een "Nou Loop" icoon zal verschijnen in de flow-boom aan de linkerkant van het scherm. Selecteert u het pictogram en klik toe te voegen "Fotometrische meten". Stel het te lezen op 400nm. </li><li> Sla uw protocol met een unieke naam, en sluit het SkanIt RE-programma. </li><li> Op de computer, opent u de PolaraRS programma. </li><li> Op de hoofdpagina zal er tabel met de instrumenten aangesloten op het RapidStak apparaat. De VarioSkan moet zich aan de linkerkant van deze tabel. Onder de VarioSkan kop, zullen er twee links: "RunSession" en "Incubate ". Klik op de" RunSession "optie. </li><li> Wordt een nieuw venster, de test venster, zal verschijnen met een stroomdiagram in het midden. Selecteer de "RunSession" item (het zou het enige punt aanwezig te zijn). Aan de rechterkant van het scherm een ​​drop-down menu zal verschijnen. Zoek de naam van uw opgeslagen SkanIt RE lopen in dit menu. </li><li> Als je eenmaal hebt gekozen uw protocol, in de rechterbovenhoek klikt u op "Uitvoeren deze test". </li><li> Een box zal verschijnen, waarin u wordt gevraagd aan te geven welk tijdschrift te gebruiken als de bron, en die het tijdschrift is leeg. Het onderste vak op het scherm komt overeen met de voorkant magazine. [Optioneel: Het vraagt ​​u om het aantal platen geladen naar een schatting voor de hoeveelheid tijd die nodig is vast te stellen. Deze schatting is normaal gesproken weg.] </li><li> Zorg ervoor dat zowel de RapidStak en de VarioSkan zijn ingeschakeld, en druk op "OK" </li><li> De RapidStak zal automatisch laad je platen in de plaat lezer, maakt de continue metingen van platen. Opmerking: Het is aanbevolen om de eerste plaat in acht laden in de VarioSkan om een ​​goede uitlijning van de machines te verzekeren. Als de RapidStak niet wordt geladen de plaat lezer goed gebruik maken van de "Pauze deze test" knop in de rechterbovenhoek van het PolaraRS venster. </li><li> Zodra de VarioSkan is gedaan het lezen van alle borden, verwijder de volledige blad en plaats het op het tijdschrift laadvloer. Til de buitenste rechthoek van het platform, en het tijdschrift zou moeten glijden, waardoor de platen staan ​​in een stapel in het midden. De platen kunnen worden afgevoerd volgens uw lab procedures. </li><li> Om de absorptie lezingen, open SkanIt RE software, exporteren en kies "Open een bestaand bestand". </li><li> Selecteer de map waarin u uw sessie, druk op de "+"-pictogram om de lijst uit te breiden en onder de titel rubriek worden opties label "Container 1" tot "Container N", afhankelijk van het aantal platen. Selecteer het eerste plaatje te analyseren. </li><li> In de menubalk aan de bovenkant van de pagina, kiest u "Data Processing&gt; Rapport / Export" </li><li> Kies de gewenste opties voor de export. Opmerking: Ik kies meestal "Plate Lay-out" en "Photometric" data voor de export. </li><li> Klik op "View Report" en dan "Bestand&gt; Opslaan". Kies de gewenste map. De output formaat is een Microsoft Excel spreadsheet </li></ol> 5. Representatieve resultaten Een voorbeeld van absorptie metingen van een enkele 384 wells plaat met daarin een positieve kloon is weergegeven in figuur 2. Positieve klonen vertonen een duidelijke toename van absorptie meer dan degenen die niet uiten cellulase activiteit. Verschillen in assay tijd, goed gelegen op de plaat, of DNP-concentratie (kunnen worden ingevoerd door te filteren op niet-opgeloste DNP) kan van invloed zijn absolute absorptie metingen. Met een relatieve absorptie metingen, zoals het verschil in absorptie boven het gemiddelde plaat of kolom gemiddelde, zijn een meer robuuste methode van het identificeren van cellulase positieve klonen. Na de identificatie van de positieve klonen uit de bibliotheek platen, is het raadzaam om alle positieve klonen repliceren naar een nieuwe plaat voor secundaire screening. Dit elimineert effecten van zowel locatie of plaat variatie en zorgt voor meer directe vergelijking tussen de positieve klonen. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Stroomdiagram van de high-throughput assay voor een metagenomic bibliotheek gekloond in E. coli en opgeslagen bij -80 ° C. <img src="/files/ftp_upload/2461/2461fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Absorbance meetwaarden van een 384-wells plaat met daarin een positieve kloon. Cellulase positieve klonen kunnen worden geïdentificeerd door de sterk toegenomen absorptie over negatieve klonen.

<ol><li>Rubin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+of+cellulosic+biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomics of cellulosic biofuels.</a> Nature. 454, 841-845 (2008).</li>
<li>Voget, S., Steele, H. L., Streit, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+metagenome+derived+halotolerant+cellulase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a metagenome derived halotolerant cellulase.</a> J. Biotechnol. 126, 26-36 (2006).</li>
<li>Duan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+partial+characterization+of+novel+genes+encoding+acidic+cellulases+from+metagenomes+of+buffalo+rumens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.</a> J. Appl. Microbiol. 107, 245-256 (2009).</li>
<li>Zhang, Y. H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outlook+for+cellulase+improvement%3A+Screening+and+selection+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Advances%22%5BJournal%5D)">Outlook for cellulase improvement: Screening and selection strategies.</a> Biotech. Advances. 24, 452-481 (2006).</li>
<li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+And+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Appl. And Environ. Microbiol. 43, 777-780 (1982).</li>
<li>Sharrock, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+assay+methods%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem+and+Biophys+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellulase assay methods: a review.</a> J. Biochem and Biophys Methods. 17, 81-106 (1988).</li>
<li>Kasana, R. C., Salwan, R., Dhar, H., Dutt, S., Gulati, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+easy+method+for+detection+of+microbial+cellulases+on+agar+plates+using+Gram%27s+Iodine%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A rapid and easy method for detection of microbial cellulases on agar plates using Gram's Iodine.</a> Curr. Microbiology. 57, 503-507 (2008).</li>
<li>Huang, J. S., Tang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+assay+for+cellulase+and+dextranase%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Sensitive assay for cellulase and dextranase.</a> Anal. Biochem. 73, 369-377 (1976).</li>
<li>Tull, D., Withers, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cellulases+and+xylanases%3A+A+detailed+kinetic+study+of+the+exo-beta-1%2C4-glycanase+from+Cellulomonas+fimi%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cellulases and xylanases: A detailed kinetic study of the exo-beta-1,4-glycanase from Cellulomonas fimi.</a> Biochemistry. 33, 6363-6370 (1994).</li>
<li>Martinez, A., Bradley, A. S., Waldbauer, J. R., Summons, R. E., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteorhodopsin+photosystem+gene+expression+enables+photophosphorylation+in+a+heterologous+host%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Proteorhodopsin photosystem gene expression enables photophosphorylation in a heterologous host.</a> PNAS. 104, 5590-5595 (2007).</li>
<li>Taupp, M., Lee, S., Hawley, A., Yang, J., Hallam, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+Insert+Environmental+Genomic+Library+Production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Large Insert Environmental Genomic Library Production.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Martinez, A., Tyson, G. W., DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+known+and+novel+phosphonate+utilization+pathways+in+marine+bacteria+revealed+by+functional+screening+and+metagenomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Widespread known and novel phosphonate utilization pathways in marine bacteria revealed by functional screening and metagenomic analyses.</a> Environ Microbiol. 12, 222-238 (2010).</li>
<li>Wild, J., Hradecna, Z., Szybalski, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditionally+amplifiable+BACs%3A+Switching+from+single-copy+to+high-copy+vectors+and+genomic+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Conditionally amplifiable BACs: Switching from single-copy to high-copy vectors and genomic clones.</a> Genome Research. 12, 1434-1444 (2002).</li>
<li>Johnson, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sacchirification+of+complex+cellulosic+substrates+by+the+cellulase+system+from+Clostridium+thermocellum%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sacchirification of complex cellulosic substrates by the cellulase system from Clostridium thermocellum.</a> Appl Environ Microbiology. 43, 1125-1132 (1982).</li>
<li>Stutzenberger, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellulase+Production+by+Thermomonospora+curvata+isolated+from+municipal+solid+waste+compost%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Cellulase Production by Thermomonospora curvata isolated from municipal solid waste compost.</a> Appl Environ Microbiol. 22, 147-152 (1971).</li>
</ol>

Een high throughput scherm voor de snelle detectie van cellulolytische activiteit van een grote insert genome DNA metagenomic bibliotheek expressie gebracht in E. coli is beschreven in dit protocol. Deze methode is een verbetering ten opzichte van de CMC / Congo Red assay vaak gebruikt in de literatuur. Het is oplossing gebaseerd, en maakt het mogelijk voor een-pot chemie screening in 384-well platen, met de uiteindelijke uitvoer als absorptie metingen van een plaat lezer waardoor kwantitatieve analyse. De auto...

<table><tbody><tr><td>qPix2</td><td>Genetix</td><td></td><td>Met 384-pins rasterhoofd</td></tr><tr><td>qFill3</td><td>Genetix</td><td></td><td>Met 384-well manifold</td></tr><tr><td>Varioskan</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RapidStak</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td>Verbonden met Varioskan</td></tr><tr><td>Micro90 Detergent</td><td>Cole-Parmer</td><td>18100-00</td><td>Verdund tot 2% in water</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Major Lab Supplier</td><td></td><td>Verdund tot 80% in water</td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0378</td><td>12.5mg/mL in ethanol</td></tr><tr><td>LB-bouillon, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426-2</td><td>25g/L, geautoclaveerd</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>384-well platen met platte bodem</td><td>Corning</td><td>3680</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-Arabinose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3256</td><td>100mg/mL in water</td></tr><tr><td>Kaliumacetaat</td><td>Fisher Scientific</td><td>P171</td><td>50mM in water, geautoclaveerd, pH ingesteld op 5.5 met HCl</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Trizma-hydrochloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td>In TE-bufferoplossing, 100mM</td></tr><tr><td>EDTA-dinatriumzout</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td>In TE-bufferoplossing, 10mM</td></tr><tr><td>2,4-dinitrofenylcellobioside</td><td></td><td></td><td>Verstrekt door Dr. Steve Withers, UBC</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr></tbody></table>

een high throughput scherm voor biomining cellulase activiteit van metagenomic bibliotheken

A High Throughput Screen for Biomining Cellulase Activity from Metagenomic Libraries

Cellulose is de meest voorkomende bron van organische koolstof op de planeet, heeft een brede industriële toepassingen met steeds meer nadruk op de productie van biobrandstoffen een. Chemische methoden aan te passen of af te breken cellulose vergen doorgaans sterke zuren en hoge temperaturen. Als zodanig zijn enzymatische methoden geworden prominent in het bioconversie proces. Terwijl de identificatie van de actieve cellulasen van bacteriën en schimmels geïsoleerd is enigszins effectief, de overgrote meerderheid van de microben in de natuur te weerstaan ​​laboratorium teelt. Milieu-genoom, ook wel bekend als metagenomic, screening benaderingen zijn een grote belofte in het overbruggen van de kloof teelt in de zoektocht naar nieuwe bioconversie enzymen. Metagenomic screening benaderingen met succes hersteld roman cellulasen uit een omgeving net zo gevarieerd als de bodem 2, buffels pens 3 en de termiet achterste gut 4 met behulp van carboxymethylcellulose (CMC) agarplaten gekleurd met congo rode kleurstof (gebaseerd op de methode van Teather en Wood 5). Echter, de CMC methode is beperkt in de doorvoer, is niet kwantitatief en manifesteert zich een lage signaal-ruisverhouding 6. Andere methoden zijn gemeld van 7,8, maar elk gebruik een agarplaat-gebaseerde test, hetgeen ongewenst is voor high-throughput screening van grote insert genomische bibliotheken. Hier presenteren wij een oplossing op basis van het scherm voor het cellulase-activiteit met behulp van een chromogene dinitrofenol (DNP)-cellobioside substraat 9. Onze bibliotheek werd gekloneerd in de pCC1 Copy Control fosmid voor het testen van de gevoeligheid te verhogen door middel van copy number inductie 10. De methode maakt gebruik van een-pot chemie in 384-wells microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing die als een absorptie meting. Deze uitlezing is kwantitatief, gevoelig en geautomatiseerd met een doorvoersnelheid van maximaal 100X 384-well platen per dag met behulp van een vloeistof handler en plaat lezer met aangehechte stapelsysteem.

Dit protocol beschrijft een high throughput scherm voor cellulolytische activiteit van een metagenomic bibliotheek uitgedrukt in Escherichia coli. Het scherm is oplossing gebaseerd en sterk geautomatiseerde, en maakt gebruik van een-pot chemie in 384 goed microtiterplaten met de uiteindelijke uitlezing als een absorptie meting.

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Cellulose, de meest overvloedige bron van organische koolstof op aarde, heeft breed scala aan industriële toepassingen, waarbij de nadruk steeds meer komt te liggen op biobrandstoffen ...

Het algemene doel van deze procedure is het identificeren van cellulase-expresserende klonen uit een metagenomische bibliotheek. Dit wordt bereikt door eerst een eerder gemaakte metagenomische bibliotheek te repliceren met behulp van een robot, gevolgd door incubatie van de gerepliceerde bibliotheek bij 37 °C gedurende 24 uur. De groei van de E. coli-klonen wordt gemeten, waarna lysisbuffer en substraat aan de gerepliceerde bibliotheek worden toegevoegd.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die cellulase-activiteit aantonen via colorimetrische absorbantiemetingen met gebruik van een platenlezer. Hallo, ik ben Keith uit het laboratorium van Steven Hallam van de afdeling Microbiologie en Immunologie aan de University of British Columbia. Vandaag laten we u een procedure zien voor de high-throughput functionele screening van metagenomische bibliotheken.Wij gebruiken deze procedure in ons laboratorium om de cellulase-activiteit van biomin te bestuderen vanuit metagenomische bibliotheken. Laten we beginnen. Bereid vóór de start van dit protocol een metagenomische bibliotheek voor die is opgeslagen in een 384-wells plaatformaat.Voor deze studie werd de PCC one copy control SMID

a-high-throughput-screen-for-biomining-cellulase-activity-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Grootschalige Schermen van Metagenomic Bibliotheken

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Beschrijven we een low cost, high throughput methode voor het screenen op schimmels endoglucanase activiteit...

High Throughput Screening van Fungal endoglucanase activiteit in Escherichia coli</em

Een eenvoudige, snelle methode voor het bepalen van de versuikering potentieel van grote aantallen van plantaardige biomassa monsters is beschreven. De geautomatiseerde platform voor deze analyse heeft betrekking op de voorbereiding van de plantaardige biomassa voor analyse in platen met 96 putjes en de daaropvolgende prestaties van de voorbehandeling, hydrolyse en kwantificering van de vrijgekomen suikers.

High-throughput versuikering test voor Lignocellulose Materialen

Source: Kim, H. et. al., Multi-enzyme Screening Using a High-throughput Genetic Enzyme Screening System. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates a genetic screening method to detect enzyme expression using metagenomic fosmid libraries and chromogenic substrates. Flow cytometry identifies and isolates single cells producing colored products, enabling high-throughput selection of active enzyme-expressing cells.

Detection of Target Enzyme Expression in Genetically Modified Bacterial Cells

Tabaksplanten werden gebruikt om een ​​schimmel cellulase, TrCel5A produceren via een tijdelijk expressiesysteem. De uitdrukking zou kunnen worden gecontroleerd met behulp van een fluorescerende fusie-eiwit, en het eiwit activiteit werd gekenmerkt post-expressie.

Expressie van recombinant Cellulase Cel5A uit<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; In tabaksplanten

De structuur en chemische eigenschappen van de plantencelmuur worden geëvalueerd om ideale grondstoffen voor biobrandstoffen en biomaterialen te identificeren. Standaardmethoden hebben beperkingen wanneer ze worden toegepast op grote datasets. Deze hoogdoorvoerpre-behandelings-, enzym-saccharificatie- en pyrolyse-moleculaire bundel massaspectrometrie-methoden vergelijken een groot aantal biomassamonsters met verminderde experimentele tijd en kosten.

High-throughput screening van weerspannigheid Variaties in lignocellulose: Total Lignine, Lignine monomeren, en enzymatische Sugar release

Dit werk presenteert een methode voor hoogdoorvoerscherming met behulp van een universeel genetisch enzymschermingssysteem dat theoretisch kan worden toegepast op meer dan 200 enzymen. Hier identificeert het enkele schermsysteem drie verschillende enzymen (lipase, cellulase en alkalische fosfatase) door eenvoudigweg het gebruikte substraat te veranderen (p-nitrofenylacetaat, p-nitrofenyl-α-D-cellobioside en fenylfosfaat).

Multi-enzym screening met een hoge verwerkingscapaciteit Genetische screening Enzyme System

Een high-throughput assay voor enzymscreening wordt beschreven. Deze multiplexed, gebruiksklare assaykit bestaat uit vooraf gekozen Chromogene Polymer Hydrogel (CPH) substraten en complexe Insoluble Chromogene Biomass (ICB) substraten. Doelenzym zijn polysacharide-afbrekende endo-enzymen en proteasen.

High-throughput screening van Carbohydrate-afbrekende enzymen via innovatieve Onoplosbare chromogeen substraat Assay Kits

Crispr Cas9-technologie biedt een efficiënte methode om het genoom van zoogdieren in elk celtype nauwkeurig te bewerken en vertegenwoordigt een nieuw middel om genoom-brede genetische schermen uit te voeren. Hier vindt u een gedetailleerd protocol over de stappen die nodig zijn voor het succesvol uitvoeren van gepoolde CRISPR Cas9 schermen.

Gepoolde CRISPR-gebaseerde genetische schermen in zoogdiercellen

Dit protocol biedt een standaard high-throughput screeningworkflow voor industriële micro-organismen. Het omvat het construeren van een mutantenbibliotheek via ARTP-mutagenese, het uitvoeren van positieve druppelscreening met geautomatiseerde microfluidica en vervolgens het verifiëren van de resultaten. De betrouwbaarheid van de workflow werd gevalideerd door het screenen van krachtige B. coagulans-stammen .

Hoogdoorvoerscreening van L-melkzuur-hyperproducerende bacilluscoagulansmutanten met behulp van een geautomatiseerd druppel-microflufluïdisch platform

Leer een high-throughput screening voor cellulase-activiteit uit metagenomische bibliotheken in Escherichia coli. Deze methode identificeert enzym-expressie via geautomatiseerde kleurmetingen.

Een High Throughput Scherm voor Biomining cellulase activiteit van Metagenomic Bibliotheken

Meer video's verkennen