Zuivering van Prototype Foamy Virus-intasomen middels grootte-uitsluitingschromatografie

Begin met een suspensie die neerslagen van prototype foamy virus of PFV-intasomen, monomerische integrases, DNA-oligomeren en eiwitaggregaten bevat.

PFV-intasomen zijn tetrameren van virale integrases gecomplexeerd met synthetische oligomeren die het virale genomische DNA nabootsen.

Voeg een zoutoplossing toe aan de suspensie en incubeer op ijs. Het zout vermindert de elektrostatische interactie tussen de intasomen, waardoor de neerslagen kunnen oplossen.

Pipette voorzichtig met regelmatige tussenpozen om de solubilisatie van het intasoom te bevorderen.

Centrifugeer om het resterende precipitaat te pelletteren en verzamel het supernatant dat de oplosbare intasomen bevat.

Neem een vooraf geëquilibreerde size-exclusion chromatografiekolom gevuld met cross-linked agarose-beads en breng het supernatant op de kolom aan.

Vanwege hun grote omvang omzeilen eiwitaggregaten en intasomen de poriën van de kralen en elueren ze eerder.

Kleinere monomerische integrases en oligomeren dringen de poriën van de kraaltjes binnen en elueren later.

Verzamel de vroeg eluerende fracties die intasomen bevatten voor verdere downstream-analyse.

Bereid twee wide-bore pipetpunten voor door met een nieuw scheermesje of scalpellamesje op een schoon oppervlak twee tot vier millimeter van het uiteinde van een 200 µL punt te verwijderen. Verwijder de dialyseslang uit de dialysebuffer. Om verdunning van het intasoommonster met dialysebuffer die aan het uiteinde van de slang nabij de clip kan achterblijven te voorkomen, dient een micropipet met een kleine pipetpunt te worden gebruikt om overtollige dialysebuffer te verwijderen.

Verwijder de clip aan dit uiteinde van de dialyseslang. Bij het terugwinnen van het complex is het belangrijk om zoveel mogelijk van de oplossing en het precipitaat te verzamelen. Gebruik de wide-bore pipetpunt om het monster, inclusief het precipitaat, vanuit de dialyseslang over te brengen naar een 1,5 milliliter buisje op ijs.

Noteer het totale volume van het teruggewonnen materiaal. Het totale volume is doorgaans ongeveer 140 µL. Het monster met het precipitaat bevindt zich in 200 mM NaCl.

Verhoog de zoutconcentratie tot een eindconcentratie van 320 millimol natriumchloride door het toevoegen van het juiste volume van een vijf molar natriumchloride-stoomoplossing. Verplaats de ijsbak met het monster naar een koelkamer van vier graden Celsius. Gebruik de wide-bore pipetpunt om het precipitaat door pipetteren opnieuw te suspenderen en te solubiliseren.

Herhaal dit elke 20 minuten gedurende ten minste één uur. Het grootste deel van het precipitaat zou in oplossing moeten gaan. Om het intasoom te zuiveren, wordt een cross-linked agarose size-exclusion chromatography- of SEC-kolom geëquilibreerd met SEC-runbuffer bij een stroomsnelheid van 0,4 milliliters per minuut.

Centrifugeer het intasome-monster in een microcentrifuge bij 14.000 ×g gedurende 10 minuten bij 4 ˚C om eventueel resterend precipitaat te pelletiseren. Verwijder voorzichtig het supernatant en breng dit over naar een injectieloep van 200 µL. Breng het monster aan op de SEC-kolom.

Elueer met 25 mL SEC-loopbuffer en verzamel 95 fracties van 270 µL. Stel vast dat het SEC-chromatogram drie A280- en A260-pieken vertoont.