Het verkrijgen van viraal RNA voor real-time kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR)-analyse

Begin met een serieel verdunde, gesynthetiseerde virale RNA-standaardoplossing in het kweekmedium.

Deze verdunningen dienen als referentiestandaarden om viraal RNA in de monsters te kwantificeren.

Neem nu het supernatant dat het virus bevat uit de virusgeïnfecteerde celcultuur.

Dit kweekmedium bevat een inhibitor die bindt aan RNA-afbrekende enzymen en de afbraak van viraal RNA voorkomt.

Voeg de verwerkingsbuffer toe die het proteinase K-enzym bevat.

Centrifuge de oplossing kort voor een gelijkmatige menging.

Plaats de PCR-plaat met de monsters in de thermocycler.

Incubeer eerst bij een matige temperatuur om proteinase K te activeren.

Dit enzym verteert de virale eiwitten die het genoom inkapselen, waardoor het virale RNA in de oplossing vrijkomt.

Incubeer vervolgens bij een hogere temperatuur om het enzym te inactiveren en het RNA te denatureren.

Bewaar tot slot de bewerkte monsters onder koude condities tot de real-time kwantitatieve PCR-analyse.

Meng eerst 19 µL verwerkingsbuffer met 1 µL nucleasevrije proteinase K. Verdun het voorbereide RNA van de 3'-UTR van het denguevirus seriële 1:10 in celcultuurmedium, door herhaaldelijk te pipetteren en te vortexen, om RNA-standaarden te verkrijgen met concentraties variërend van 5 x 10⁹ tot 5 x 10³ kopieën/µL. Breng 5 µL van het cultuursupernatans van met het denguevirus geïnfecteerde cellen en de RNA-standaard van de 3'-UTR van het denguevirus over naar PCR-strips van 8 buisjes of de putjes van een 96-well PCR-plaat.

Voeg vijf microliters van de oplossing met verwerkingsbuffer en proteinase K toe. Centrifugeer kortstondig bij 20 ×g gedurende vijf seconden. Incubeer de monsters in een thermocycler bij 25 °C gedurende tien minuten en vervolgens bij 75 °C gedurende vijf minuten.