Oogsten van hepatitis E-virusdeeltjes uit menselijke leverkankercellen

Begin met een cultuur van humane leverkankercellen die zijn getransfecteerd met hepatitis E-virus (HEV) RNA om viruspartikels te produceren.

Sommige HEV's verkrijgen een endosomale membraan afgeleid van de gastheer en verlaten de cel, terwijl andere in de cel achterblijven als niet-omhulde HEV's.

Om extracellulaire HEV's te oogsten, verzamelt en filtert u het cultuursupernatans om celresten te verwijderen.

Bewaar bij een ultralage temperatuur om de infectiviteit te behouden.

Was de cellen met een buffer om intracellulaire HEV's te oogsten.

Voeg trypsin-EDTA toe om de cellen los te maken en voeg vervolgens medium toe om de enzymatische activiteit te stoppen.

Breng de suspensie over in een buis en centrifugeer.

Gooi het supernatant dat residuele trypsine bevat weg. Resuspendeer het pellet en breng het over naar een buisje.

Bevries de cellen in vloeibare stikstof en ontdooi ze op ijs.

Herhaal de vries-dooi-cycli om de cellen te lyseren, waardoor de virussen vrijkomen.

Centrifugeer het mengsel, verzamel het supernatant dat de virussen bevat en bewaar dit bij een ultralage temperatuur.

Filter op dag zes het supernatant door een gaas van 0,45 micrometer om eventuele celresten te verwijderen en bewaar het geoogste extracellulaire hepatitis E-virus uit celkweek bij vier graden Celsius. Voor het oogsten van intracellulaire hepatitis E-virusdeeltjes uit celkweek worden de cellen gewassen met PBS en losgemaakt met 1,5 milliliter 0,05% trypsine-EDTA bij 37 graden Celsius. Wanneer de cellen zijn losgekomen, wordt de reactie gestopt met 8,5 milliliter DMEM en wordt de celsuspensie overgebracht naar een buis van 50 milliliter voor centrifugatie.

Voeg 1,6 milliliters DMEM volledig medium per electroporatie toe aan individuele reactiebuisjes van twee milliliter en gebruik 800 microliters van het medium om de cellen te resuspenderen, waardoor de cellen naar de buisjes worden overgebracht. Vries de cellen in vloeibare stikstof in en ontdooi de cellen vervolgens drie keer op ijs voordat de resulterende lysaten gedurende 10 minuten bij 10.000 times g met hoge snelheid worden gecentrifugeerd. Draag vervolgens de supernatanten over naar nieuwe buisjes zonder de pellets van celdebris te verstoren voor bewaring bij minus 80 graden Celsius.