Zuivering van virus uit de allantoïsvloeistof van embryonerende kippeneieren

Begin met een reservoir met allantoïsvloeistof die is geoogst uit virus-geïnfecteerde kippeneieren.

Deze vloeistof bevat virusdeeltjes samen met contaminanten afkomstig van de gastheer.

Leid de vloeistof door een dieptefilter om grote verontreinigingen op te vangen, terwijl kleinere verontreinigingen en virussen kunnen passeren.

Laad vervolgens de gefilterde vloeistof in een filtratiesysteem, waar deze tangentieel over een membraanoppervlak stroomt.

Kleinere verontreinigingen passeren door het membraan, terwijl het virus wordt vastgehouden en geconcentreerd.

Laad het geconcentreerde virus op een dichtheidsgradiënt en centrifugeer dit. Het virus vormt een duidelijke band op het punt waar de dichtheid ervan overeenkomt met die van de gradiënt.

Verzamel de virusrijke band in een dialyse cassette en plaats deze in een buffer. De gradiëntcomponenten diffunderen naar buiten, terwijl water uit de buffer via het semipermeabele membraan naar binnen diffundeert.

Plaats de cassette vervolgens in een hypertone oplossing om water te onttrekken en het gezuiverde virus te concentreren.

Voor de zuivering van het Newcastle-ziektevirus of NDV wordt eerst het eerder ingerichte experimentele systeem voorbereid door er 50 milliliters PBS doorheen te laten lopen.

Stop de pomp wanneer er ongeveer vijf milliliter PBS in de buis overblijft. Bevestig vervolgens een dieptefilter met een retentiegraad van één tot drie micrometer aan de slang. Om het filter te ontluchten, verwijdert u de tweede dop aan de apicale zijde van het dieptefilter en laat u vervolgens nog eens 50 milliliter PBS door het systeem lopen.

Zodra de PBS door de ontluchting aan de bovenkant van het filter begint te stromen, sluit u de poort en laat u de PBS door de leidingen blijven stromen. Vervang daarna het afvalreservoir door een nieuw steriel opvangreservoir en begin met het laten stromen van allantoïsvloeistof door het dieptefilter. Stel vervolgens het tangential flow filtratie- of TFF-systeem in een open configuratie in en voer dit uit zoals beschreven in het manuscript.

Wanneer er ongeveer vijf milliliter vloeistof in het reservoir over is, wordt de pomp gepauzeerd en wordt er dieptegefiltereerde allantoïsvloeistof aan het reservoir toegevoegd. Hervat vervolgens de pompstroom. Om afschuiving van het virus te voorkomen, is het belangrijk om ervoor te zorgen dat de systeemdruk 10 pound force per square inch niet overschrijdt.

Om de elutie te verhogen, dient een combinatie van de snelheid van de peristaltische pomp en C-klemmen te worden gebruikt. Wanneer er 150 tot 10 milliliters allantoïsvloeistof in het reservoir overblijft, wordt de pomp gepauzeerd en de buffer vervangen door het toevoegen van 150 tot 200 milliliters ML-buffer. Pauzeer de pomp opnieuw wanneer er vijf tot 10 milliliters vloeistof in het reservoir overblijft en sluit vervolgens de afvoerlijnen met twee C-klemmen.

Koppel de retentaatlijn die het reservoir voedt los en plaats deze in een conische buis van 50 milliliter. Hervat vervolgens de stroom en pauzeer wanneer er nog maar enkele druppels vloeistof in het reservoirtankje over zijn. Verwijder daarna de C-klemmen van de afvallijnen en sluit de retentaatvoedingslijn opnieuw aan op het reservoirtankje.

Bereid ondertussen de iodixanol-dichtheidsgradiënt-ultracentrifugatie voor door eerst 0,5 milliliter 40% iodixanol toe te voegen aan een 13,2 milliliter open-top thin-wall ultracentrifugebuis. Maak vervolgens de kolom gereed door opeenvolgend 2,5 milliliter 20% iodixanol en 2,5 milliliter 10% iodixanol toe te voegen. Voeg vóór de ultracentrifugatie voorzichtig zes tot 6,5 milliliter van de uit het TFF-systeem geëlueerde virusoplossing toe aan de iodixanolkolom, zonder de gradiënt te verstoren.

Verwijder na de ultracentrifugatie de buizen met een steriele pincet. De doelband moet een brede band zijn tussen de 10% en 20% gradiënten. Hang de buis vervolgens met een statief boven een bekerglas.

Bevestig daarna een naald van 1,5 inch en 18 gauge aan een spuit van vijf milliliter, punctureer vervolgens de zijkant van de ultracentrifugebuis met de naald en verwijder de doelband door de zuiger langzaam uit te trekken. Na het verwijderen van iodixanol uit de virusoplossing, zoals beschreven in het manuscript, gebruik een spuit om het virus voorzichtig in een dialysecassette te injecteren. Om de virusoplossing te concentreren, verwijder de dialysecassette uit de dialysebuffer en plaats deze in een klein afsluitbaar plastic zakje.

Voeg vervolgens 15 tot 25 milliliters van 40% polyethyleenglycol toe aan de zak, zodat de dialysecassette volledig is ondergedompeld.