Sendai-virus-gemedieerde herprogrammering van menselijke bloedcellen tot geïnduceerde pluripotente stamcellen

Neem een cultuur van humane perifere bloedmononucleaire cellen (PBMCs).

Voeg Sendai-virus toe dat de herprogrammerende transcriptiefactoren codeert. Dek de plaat af en verzegel deze.

Centrifugeer om het contact tussen virus en cel te verbeteren en incubeer.

Na de virusfusie zorgt het virale RNA voor de expressie van transcriptiefactoren die cellulaire pluripotentiegenen activeren en lineage-specifieke genen onderdrukken om de herprogrammering te initiëren.

Tijdens dit proces converteert een subpopulatie van getransduceerde PBMCs naar geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) en worden adhesie-eiwitten tot expressie gebracht.

Breng ze over naar een met matrix gecoate well en centrifugeer de cellen. Vervang het supernatant door een groeimedium.

Na incubatie hechten de iPSCs zich aan de matrix, terwijl de getransduceerde niet-adherente PBMC's in suspensie blijven.

Breng de suspensie over naar een gecoate well en centrifugeer deze. Voeg het medium toe aan de oorspronkelijke well en incubeer beide.

De resterende getransduceerde PBMCs starten de herprogrammering, converteren naar iPSCs en hechten aan. Deze stap maximaliseert de retentie van herprogrammeerde cellen.

Vervang het medium dagelijks om de groei van iPSC te ondersteunen.

Overdracht de bloedcellen naar een conische buis van 15 milliliter en tel deze met een hemocytometer. Bereid vervolgens 3 x 10⁵ cellen voor voor transductie en centrifugeer de cellen bij 515 x g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Verwijder daarna het supernatant door middel van aspiratie en resuspendeer de cellen in 0,5 milliliters bloedcelmedium. Breng de cellen vervolgens over naar een well van een niet-gecoate 24-wells plaat. Ontdooi het Sendai-virusmengsel op ijs en voeg dit toe aan de gesuspendeerde cellen.

Sluit de plaat af met een afdichtfilm en centrifugeer deze bij 1.150 ×g gedurende 30 min bij 30 °C. Incubeer de cellen na centrifugatie gedurende de nacht bij 37 °C in 5% CO2. Om de volgende dag een 24-wells plaat te coaten met vitronectine, wordt de vitronectine-oplossing verdund in PBS tot een eindconcentratie van 5 µg/ml.

Voeg vervolgens één milliliter vitronectine toe aan een well en incubeer deze gedurende ten minste één uur bij kamertemperatuur. Verwijder daarna de coating-oplossing en breng al het medium dat de cellen en het virus bevat over naar de gecoate well. Verzamel vervolgens de resterende cellen met een extra 0,5 milliliter vers bloedcelmedium en voeg dit toe aan de well met cellen.

Centrifuge de plaat vervolgens 10 min bij 1.150 ×g en 35 °C, en houd de cellen daarna gedurende de nacht bij 37 °C in 5% CO2. Coat voor de tweede celoverdracht de well met 5 µg/ml vitronectine, zoals eerder beschreven. Gebruik één well van de plaat per transductie en breng de celsuspensie van de eerste plaat over naar de nieuw gecoate vitronectineplaat.

Voeg ondertussen één milliliter iPSC-medium toe aan een well van de eerste plaat voor onderhoud en incubeer deze bij 37 °C in 5% CO2, met een dagelijkse mediumverversing met vers iPSC-medium. Kolonies zullen verschijnen op dag 14 tot 21 na de transductie. Centrifugeer de nieuw gecoate plaat met de gesuspendeerde cellen bij 1.150 ×g bij 35 °C gedurende tien minuten.

Incubeer de cellen na centrifugatie gedurende de nacht bij 37 °C in 5% CO2. Verwijder de volgende dag het supernatant en vervang dit door vers medium voor geïnduceerde pluripotente stamcellen. Houd de gehechte cellen in stand door het medium dagelijks te verversen, totdat een confluentie van 80% is bereikt.