Analyse van influenza-virusinternalisatie met behulp van een streptavidine-blokkeringsassay

Begin met buizen die menselijke longepitheelcellen bevatten.

Voeg gebiotineerde influenzavirussen toe en incubeer op ijs. De virussen binden aan het celoppervlak zonder geïnternaliseerd te worden.

Centrifugeer om de virusgebonden cellen te scheiden, verwijder het supernatant en resuspendeer.

Voeg in de buis van het beginstijdstip niet-gemarkeerd streptavidine toe, dat bindt aan de gebiotinyleerde virussen en complexen vormt.

Voeg fluorofoor-gelabelde streptavidine toe, die niet bindt aan het streptavidine-biotine-viruscomplex. Was en fixeer de cellen.

Incubeer de buis van het latere tijdstip bij een hogere temperatuur om internalisatie van het virus mogelijk te maken, en plaats deze vervolgens terug op ijs.

Voeg ongelabelde streptavidine en een internalisatie-blokkerend middel toe, dat verdere virale opname voorkomt, en incubeer. Streptavidine bindt oppervlaktegebonden gebiotinyleerde virussen, waarna gewassen wordt.

Fixeer de cellen en voeg een buffer met detergent toe om ze te permeabiliseren.

Was de cellen en voeg fluorofoor-gelabellede streptavidine toe, dat de cellen binnendringt en bindt aan biotine.

Analyseer de monsters via flowcytometrie.

Een hogere fluorescentie op het latere tijdstip bevestigt een succesvolle virale internalisatie.

Nadat het wassen nog een keer is herhaald, worden de buisjes gedurende 10 minuten op ijs gekoeld. Wanneer de buisjes zijn afgekoeld, worden ze opnieuw gecentrifugeerd en worden 10 µL gebiotinylated virus, verdund in infectie-PBS, gebruikt om de pellets te resuspenderen na incubatie op ijs gedurende één uur. Herhaal het centrifugeren en was twee keer met PBS, waarbij de volgende monsters voor de nulminuten-tijdspunten zoveel mogelijk parallel worden verwerkt.

Om de monsters van nul minuten plus STV te behandelen, centrifugeert u de buisjes, verwijdert u het supernatant en gebruikt u 15 µL STV met 2% BSA en 0,1% natriumazide in PBS om de celpellet opnieuw te suspenderen. Incubeer 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens en gebruik PBS om de cellen tweemaal te wassen na fixatie met PFA zoals zojuist gedemonstreerd; bewaar de monsters bij vier °C.

Voor de monsters met 30 minuten plus STV. Resuspendeer na het centrifugeren de monsters in 20 µL PBS 2% BSA, na een incubatie van 30 minuten bij 37 °C.

Centrifugeer en resuspendeer de cellen in 50 µL van STV 2% BSA 0,1% natriumazide in PBS; incubeer dit 30 minuten op ijs voordat u gaat wassen en fixeren. Bewaar de monsters vervolgens op vier graden Celsius nadat alle monsters zijn gepermeabiliseerd en gekleurd met STV-Cy3, volgens de details in het tekstprotocol. Analyseer tot slot de monsters via flowcytometrie.