Beoordeling van faag-gemedieerde remming van bacteriële groei met behulp van optische dichtheidsmetingen

Begin met een multiwellplaat met een seriële verdunningsreeks van een faagsuspensie in voedingsrijke bouillon als behandeling en bouillon zonder faag als controle.

Voeg E. coli toe aan elke put. Meet met een spectrofotometer de basis optische dichtheid (OD) om de initiële bacteriële concentratie vast te leggen.

Incubeer vervolgens de plaat om bacteriële groei en fage-infectie mogelijk te maken.

In de controle gebruiken bacteriën voedingsstoffen en prolifereren ze, waardoor de OD toeneemt.

Bij de behandeling binden fagen zich aan bacteriële oppervlaktereceptoren en injecteren zij hun genomen in het cytoplasma.

Met behulp van de machinerie van de gastheercel repliceert het virale genoom en worden virale eiwitten geproduceerd, die samen nieuwe virusdeeltjes vormen. Deze deeltjes lyseren de cel, waardoor het nageslacht vrijkomt.

Meet de OD met tussenpozen om de bacteriële groei te vergelijken.

Controleputjes vertonen een progressieve toename van de OD, terwijl met fagen behandelde putjes lagere OD-waarden vertonen, waarbij de reducties groter zijn bij hogere fagenconcentraties.

Dit helpt bij het bepalen van de faagconcentratie die nodig is voor maximale remming van de bacteriële groei.

Begin met het opzetten van de microplate-assay met gebruik van gefilterde tips om kruiscontaminatie te voorkomen. Voeg eerst 180 µL mTSB toe aan de wells van kolommen 1 tot en met 12 van de 96-well microplate. Bereid vervolgens seriële tienvoudige verdunningen van elke fage voor in kolommen 1 tot en met 8 van de steriele 96-well microplates om de assay op te zetten. Voeg 20 µL individuele fagen of fagen-cocktails toe aan de wells 1 tot en met 8 van de bovenste rij A van de microplate.

Voeg voor de fagenvrije en blanco controle 20 µL mTSB toe aan de bovenste well van kolommen negen tot 12. Meng tijdens het pipetteren de inhoud van de well door minstens vijf keer voorzichtig en herhaaldelijk te aspireren en vervang de tips tussen de verdunningen. Verwijder 20 µL uit de laatste rij H en stel vervolgens een reservoir voor de geteste bacteriële stam op door twee tot drie mL van de verdunde cultuur met een pipette van 1 mL in het reservoir over te brengen.

Voeg met een meerkanaalpipet 20 µL van de verdunde bacteriële cultuur toe aan elke put in kolommen 1 tot 10, waarbij de tips tussen elke toevoeging worden gewisseld. Dek de microplaat af en incubeer deze bij 37 °C. Haal de microplaat om de twee uur uit de incubator en lees de plaat af met een microplaatlezer.

Incubeer de plaat alternatief in een microplatereader en lees deze gedurende een bepaalde tijd af.