JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 2:48 min. • August 31st, 2026
Neem een mammaliale celcultuur in de stationaire fase met minimale DNA-replicatie en verzamel het geconditioneerde medium.
Voeg herpes simplex virus (HSV) toe en incubeer met af en toe schudden om virale aanhechting mogelijk te maken. Was om het ongebonden virus te verwijderen en herstel het geconditioneerde medium.
Na incubatie fuseert het virus met het gastheermembraan, waarbij het nucleocapsid in het cytoplasma wordt vrijgegeven.
Het viraal dsDNA komt de kern binnen, circulariseert en tot expressie viraal eiwitten voor viraal DNA-replicatie.
De virale en gastheerproteïnen ontwinden het viraal DNA en synthetiseren een RNA-primer. Vervolgens bindt het virale DNA-polymerasecomplex en verlengt het de primer voor DNA-synthese.
Terwijl de replicatie vordert, wordt een nucleoside-analoog aan de cultuur toegevoegd. Deze dringt de cellen binnen en wordt omgezet in een trifosfaatvorm.
Omdat de DNA-replicatie van de gastheer minimaal is, wordt het analoog bij voorkeur ingebouwd in replicerend viraal DNA, waardoor de virale genomen worden gelabeld.
De gelabelde virale genomen zijn klaar voor verdere proteomische analyse van de geassocieerde eiwitten.
Begin deze procedure met het kweken van MRC-5-cellen zoals beschreven in het tekstprotocol. Verdun vervolgens HSV-1 in koude tris-gebufferde zoutoplossing of TBS. Voor de volgende stappen is het belangrijk om de ventilator en de weefselkweekkast uit te schakelen om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
Gebruik een pipet om het groeimedium van de MRC-5-cellen over te brengen naar een steriele fles, om dit na infectie weer aan de cellen toe te voegen. Infecteer de cellen door zeven milliliter verdund virus aan de cellen toe te voegen. Schud de cellen elke 10 minuten gedurende één uur bij kamertemperatuur.
Aspiratie het inoculum na adsorptie, spoel de cellen met 50 milliliter TBS op kamertemperatuur en voeg het oorspronkelijke groeimedium opnieuw toe. Incubeer de cellen vervolgens bij 37 graden Celsius in de aanwezigheid van 5% koolstofdioxide. Label het replicerende virale DNA na het begin van de virale DNA-replicatie, ongeveer vier uur na infectie.
Doe dit door EdC te verdunnen in één milliliter groeimedium en dit gedurende twee tot vier uur toe te voegen aan het celkweekmedium van de geïnfecteerde cellen.