Isolatie van eiwitten uit viraal DNA-eiwitcomplexen

Neem de celkernen die viraal genoom bevatten, gelabeld met alkyn-gemodificeerde nucleotiden.

Suspendeer de kernen in een mengsel van biotin-azide en koperionen en incubeer.

Het koperion helpt bij de covalente binding van de azide- en de alkyngroep.

Centrifugeer en verwijder de supernatant.

Resuspendeer in buffer, breng over en centrifugeer om een pellet te vormen.

Vries het pellet snel in en ontdooi het vervolgens om de lysis te vergemakkelijken.

Resuspendeer en sonicizeer om de kernen te lyseren.

Centrifugeer en verzamel het supernatant dat de eiwit-viraal DNA-complexen bevat.

Filtreer het supernatant om contaminanten te verwijderen.

Verdun het filtraat.

Voeg streptavidine-gecoate magnetische beads toe en incubeer om de binding met gebiotinyleerde eiwit-DNA-complexen te vergemakkelijken.

Pas een magnetisch veld toe om de kraaltjes te verzamelen en was deze om contaminanten te verwijderen.

Herhaal het wassen.

Voeg een elutiebuffer toe en verhit om de eiwitten te scheiden en te denatureren.

Scheid de kraaltjes en verzamel het eluaat.

Vries de geïsoleerde eiwitten snel in. Bewaar ze bij ultralage temperaturen voor verdere analyse.

Nadat de PBS volledig is verwijderd, wordt het nucleaire pellet opnieuw gesuspendeerd in 10 milliliter click-reactiemengsel door vijf keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een 10 milliliter pipette. Roteer het monster gedurende één uur bij vier graden celsius, alvorens de kernen zoals eerder beschreven te pelleteren.

Verwijder het clickreactiemengsel volledig en was vervolgens de pellet door deze voorzichtig opnieuw te suspenderen in 10 milliliters PBS en opnieuw te centrifugeren. Suspendeer nu de nucleaire pellet zorgvuldig opnieuw in één milliliter PBS en breng de oplossing over naar een 1,5 milliliter microcentrifugebuisje. Verwijder na centrifugatie het PBS volledig en vries de pellet snel in vloeibare stikstof.

Op dit punt kan de pellet worden bewaard bij 80 °C of kan de procedure worden voortgezet. Om de kernen te lyseren en het DNA te fragmenteren, worden de ontdooide kernen opnieuw gesuspendeerd in 50 µL Buffer B1 door herhaaldelijk te pipetteren. Incubeer de suspensie 45 minuten op ijs.

Sonicide vervolgens de monsters zes keer gedurende 30 seconden per keer bij 40% amplitude, met behulp van een microtip-probe van drie millimeter. Plaats de monsters gedurende ten minste 30 seconden op ijs tussen de pulsen door. Na sonificatie moeten de monsters helder zijn en niet troebel.

Pellet de celresten door te centrifugeren bij 14.0 x G gedurende 10 minuten bij vier graden celsius. De grootte van het pellet moet aanzienlijk afnemen; filtreer het supernatant door een 10 micron cell strainer en behoud het doorstroomvolume. Voeg vervolgens 50 microliters Buffer B2 toe aan het gefilterde supernatant.

Om het gebiotineerde DNA aan streptavidine-gecoate beads te binden, worden de streptavidine-magnetische beads voorbereid door 30 µL van de bead-slurry over te brengen naar een 1,5 mL microcentrifugebuis. Bereid één buis met beads voor per monster. Was de beads drie keer met 1 mL Buffer B2 door te vortexen om opnieuw te suspenderen, een magneet te gebruiken om de beads te scheiden en de wasbuffer weg te zuigen.

Voeg vervolgens 90 µL van het monster toe aan de gewassen beads. Het resterende deel van het monster zal worden gebruikt voor de isolatie van input-DNA en eiwitten. Laat de suspensie een nacht roteren bij 4 °C.

Plaats de monsters de volgende dag in een magnetisch microcentrifugebuisrek en verwijder het supernatant. Resuspendeer de beads voorzichtig in één milliliter Buffer B2, alvorens deze vijf minuten bij vier graden celsius te roteren. Verwijder het supernatant opnieuw met behulp van het magnetische microcentrifugebuisrek.

Resuspendeer de beads nu voorzichtig in één milliliter Buffer B3 en roteer dit gedurende vijf minuten bij 4 °C. Verwijder de supernatant van het bead-mengsel met behulp van de magneet en resuspendeer de beads vervolgens in 50 µL 2x Laemmli-monsterbuffer om de DNA-proteïnecomplexen te elueren. Kook daarna de monsters 15 minuten lang bij 95 °C.

Vortex het mengsel voordat de monsters snel worden gecentrifugeerd in een microcentrifuge. Plaats de monsters op de magneet en breng het eluaat over naar een nieuwe buis. Vries de monsters tot slot snel in en bewaar ze bij 80 °C.

Voer de proteïneanalyse uit zoals beschreven in het tekstprotocol.