JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 4:35 min. • August 31st, 2026
Begin met mammalische cellen die zijn geïnfecteerd met een adenovirus.
Voer herhaalde vries-dooi-cycli uit om de cellen te lyseren en de virionen vrij te maken.
Centrifugeer het lysaat om het debris te pelletteren. Verzamel het supernatant dat de virusdeeltjes bevat.
Breng het virale supernatant aan op een stapsgewijze cesiumchloridegradiënt voor scheiding op basis van dichtheid.
Ultracentrifuge om de virale deeltjes te laten migreren op basis van hun drijfvermogensdichtheden.
Intacte virionen die het volledige adenovirale genoom bevatten zijn dichter vanwege het verpakte DNA en bezinken in een lagere band, terwijl lichtere, lege capsiden en debris in de bovenste lagen achterblijven.
Verwijder de bovenste lagen. Verzamel de onderste band met genoombevattende virionen.
Resuspendeer de virionen in cesiumchloride met een uniforme dichtheid en centrifugeer opnieuw in de ultracentrifuge om de scheiding te verfijnen en de volledige partikels te concentreren.
Verwijder de bovenste lagen en vang de onderste band op.
Dialyse het monster om het cesiumchloride te verwijderen.
De hoogzuivere, genoombevattende adenovirale vectoren zijn nu gereed voor verdere toepassingen.
Om het virale lysaat voor cesiumchloride-gradiëntzuivering voor te bereiden, wordt de cel-virus-suspensie vier keer bevroren en ontdooid. Centrifugeer het virale lysaat vervolgens 8 minuten lang bij 500 ×g bij kamertemperatuur.
Verzamel vervolgens het supernatant dat het high-capacity adenovirus bevat. Pipetteer voorzichtig en langzaam cesiumchloride-oplossingen in de buizen in de volgende volgorde: 0,5 milliliters van een 1,5 grams per cubic centimeter oplossing, drie milliliters van een 1,35 grams per cubic centimeter oplossing en 3,5 milliliters van een 1,25 grams per cubic centimeter oplossing. Breng ongeveer 4,5 milliliters van het geklaarde vectorsupernatant aan bovenop de 1,25 grams per cubic centimeter laag.
Centrifugeer de gradiënten in een ultracentrifuge met een swing-out rotor bij 12 °C gedurende ten minste twee uur bij 226.000 ×g om de virale deeltjes die het high-capacity adenovirus-genoom bevatten te scheiden van lege deeltjes en celdebris. Na de centrifugatie vormt zich bovenin de buizen een diffuse band van celdebris. Daaronder kunnen twee witte banden worden waargenomen.
De bovenste band bevat lege deeltjes, terwijl de onderste band het high-capacity adenovirus is. Verwijder voorzichtig de lagen met celresten en lege deeltjes. Verzamel vervolgens één milliliter van de onderste banden uit elke buis.
Breng het virus over naar een steriele buis van 50 milliliter. Voeg maximaal 24 milliliter cesiumchlorideoplossing van 1,35 gram per kubieke centimeter toe aan de verzamelde viruspartikels en meng voorzichtig. Vul de centrifugebuizen tot de rand met de virusoplossing van 1,35 gram per kubieke centimeter cesiumchloride.
Centrifuge vervolgens gedurende de nacht bij 226.000 ×g bij 12 °C in een ultracentrifuge met een swing-out rotor, met een langzame acceleratie en deceleratie. Verwijder de bovenste lagen van de top met een pipet. Verzamel daarna het high-capacity adenovirus dat aanwezig is in de prominente onderste band met een nieuwe pipetpunt.
Dialyse tot slot de verzamelde virusdeeltjes voor bufferuitwisseling. Titreer vervolgens de uiteindelijke preparaat volgens de gedetailleerde instructies in het schriftelijke protocol.