JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 2:08 min. • August 31st, 2026
Begin met een bioreactorsysteem dat een gedecellulariseerd rattenleversteunweefsel bevat dat is herbevolkt met menselijke levercellen.
Het steunstructuur wordt onderhouden in een flowsysteem dat medium circuleert om voedingsstoffen aan te voeren.
Vul een spuit met een buffer die een recombinant adeno-geassocieerd virusvector bevat.
De vector bevat zelf-complementair DNA met een transgeen cassette die een fluorescente reporter en een gene-silencing RNA coderen.
Stop de mediastroom en koppel de instroomslang los.
Injecteer de vector via het belangrijkste bloedvat dat het scaffold van voeding voorziet.
Incubeer om interactie tussen vector en cel mogelijk te maken.
De vector dringt de levercellen binnen via receptor-gemedieerde endocytose.
Eenmaal binnen ontsnapt de vector uit het endosoom en geeft deze zijn zelfcomplementaire DNA af in de nucleus.
Zelfcomplementair DNA maakt directe expressie van het transgen mogelijk, waarbij een fluorescent eiwit en gene-silencing RNA worden geproduceerd.
Hervat geleidelijk de mediastroom om de circulatie door het scaffold te herstellen.
Het getransduceerde levermodel is nu geschikt voor verdere analyse.
Transduce nu het levermodel. Laad eerst 27 biljoen vectoren in vijf milliliter PBS in een spuit. Er kan fenolrood worden toegevoegd in een concentratie van 5 µg/ml.
Koppel vervolgens de lever los van het mediacircuit en injecteer de vectoren in het systeem. Incubeer het systeem na injectie gedurende één uur zonder pompen. Verhoog daarna geleidelijk de doorstroming zoals eerder beschreven.
Vervolgens, terwijl de getransduceerde lever gedurende zes dagen wordt geïncubeerd, dient elke tweede dag 50 milliliter van het medium te worden vervangen.