JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 2:27 min • August 31st, 2026
Begin met bevroren recellulariseerd ratleverweefsel, met menselijke hepatocyten, ingebed in cryomedium.
In dit weefsel brengen de getransduceerde hepatocyten het emerald green fluorescent protein (EmGFP tot expressie), een reportereiwit dat door de virale vector wordt gecodeerd.
Gebruik een cryotoom om dunne coupes te snijden die de cellulaire en weefselstructuur behouden. Breng de coupes over naar een objectglas.
Behandel de coupes met een mild detergent om het celmembraan te permeabiliseren.
Breng een anti-EmGFP primair antilichaam aan dat specifiek bindt aan het fluorescerende reportereiwit dat in getransduceerde cellen tot expressie komt.
Was om ongebonden antilichamen te verwijderen.
Voeg een secundair antilichaam toe dat is geconjugeerd aan een rood fluorofoor, dat bindt aan het primaire antilichaam, en was vervolgens.
Voeg een DNA-specifieke blauwe fluorescente kleurstof toe die bindt aan cellulair DNA.
Onder een fluorescentiemicroscoop bevestigt de colocalisatie van rode fluorescentie met blauw gekleurde kernen dat de getransduceerde hepatocyten in het leverweefsel het virale reportereiwit succesvol tot expressie brengen.
Snij met een scalpel monsters uit elke leverkwab van ongeveer een halve centimeter dik en 1,5 tot 2 centimeter lang. Incubeer de plakjes in 4% paraformaldehyde met 4% sucrose gedurende 90 minuten bij 4 °C.
Was vervolgens de monsters drie keer met PBS gedurende één minuut per wasbeurt. Volg de wasbeurten door de monsters een nacht lang te incuberen in 8% sucrose bij vier graden Celsius. Laad de volgende dag de monsters in cryomolds die een hoeveelheid fixatiummedium bevatten.
Voorkom het introduceren van luchtbellen. Zodra ze zijn geplaatst, moeten de monsters volledig worden bedekt met fixatium en op min 80 graden Celsius worden bewaard. Zodra ze bevroren zijn, bereid worden er met een cryotoom cryosecties van 10 micron uit de monsters.
Kleur de monsters naar behoefte om de recellularisatie te bevestigen.