JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 3:33 min. • August 31st, 2026
Neem een menselijke celcultuur.
Voeg lentivirussen toe die een conditionele, op gastheer-mRNA gerichte shRNA coderen onder een tetracycline-responsieve promotor die gefuseerd is aan een operator.
Het lentivirus draagt daarnaast genen voor een tetracycline-repressor en een antibioticum-resistentie-eiwit, geplaatst onder een constitutieve promotor.
Incubeer om de overdracht van viraal RNA in de gastheercellen mogelijk te maken.
Het RNA wordt omgezet in cDNA en integreert in het genoom van de gastheer.
Was het de cellen, voeg medium toe en incubeer om de expressie van de tetracycline-repressor en het antibioticum-resistentie-eiwit mogelijk te maken, waardoor getransduceerde cellen ontstaan. De tetracycline-repressor bindt aan de operator en onderdrukt de shRNA-expressie.
Wassen, medium aangevuld met antibiotica toevoegen en incuberen.
Getransduceerde cellen brengen het antibioticaresistentie-eiwit tot expressie, waardoor ze selectief kunnen overleven in de aanwezigheid van het antibioticum.
Voeg doxycycline, een tetracycline-analoog, toe aan de cultuur.
Doxycycline bindt aan de tetracycline-repressor, waardoor de binding aan de operator wordt voorkomen en de expressie van shRNA mogelijk wordt.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's