JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 3:33 min • August 31st, 2026
Neem een menselijke celcultuur.
Voeg lentivirussen toe die een conditionele, op gastheer-mRNA gerichte shRNA coderen onder een tetracycline-responsieve promotor die gefuseerd is aan een operator.
Het lentivirus draagt daarnaast genen voor een tetracycline-repressor en een antibioticum-resistentie-eiwit, geplaatst onder een constitutieve promotor.
Incubeer om de overdracht van viraal RNA in de gastheercellen mogelijk te maken.
Het RNA wordt omgezet in cDNA en integreert in het genoom van de gastheer.
Was het de cellen, voeg medium toe en incubeer om de expressie van de tetracycline-repressor en het antibioticum-resistentie-eiwit mogelijk te maken, waardoor getransduceerde cellen ontstaan. De tetracycline-repressor bindt aan de operator en onderdrukt de shRNA-expressie.
Wassen, medium aangevuld met antibiotica toevoegen en incuberen.
Getransduceerde cellen brengen het antibioticaresistentie-eiwit tot expressie, waardoor ze selectief kunnen overleven in de aanwezigheid van het antibioticum.
Voeg doxycycline, een tetracycline-analoog, toe aan de cultuur.
Doxycycline bindt aan de tetracycline-repressor, waardoor de binding aan de operator wordt voorkomen en de expressie van shRNA mogelijk wordt.
Het shRNA wordt verwerkt tot siRNA, dat wordt geladen in RISC en het doel-mRNA afbreekt.
Hiermee worden doxycycline-afhankelijke conditionele knockdown-cellen gegenereerd.
Om stabiele cellijnen te genereren, begint u met het uitplaten van HCT-116 colonkankercellen en MDA-MB-231 borstkankercellen in een 12-well plaat met 50.000 cellen per well.
Incubeer bij 37 °C en 5% CO2. Wanneer de cellen 60-70% confluent zijn, was de cellen met PBS en voeg één milliliter virushoudend medium toe aan elke well. Verwijder de volgende dag voorzichtig het virushoudende medium door aspiratie.
Was de cellen vervolgens met PBS en voeg medium toe dat tetracycline-vrij FBS bevat. Was na 72 uur de cellen opnieuw en voeg medium toe, aangevuld met 1 µg/mL puromycine, voor de selectie van virus-getransduceerde cellen. Selecteer de virus-getransduceerde cellen door de cellen gedurende 3 tot 14 dagen te kweken in de aanwezigheid van puromycine.
Observeer gedeeltelijke doding van de cellen door puromycine in de wells met virusgetransduceerde cellen. Niet-getransduceerde cellen zullen niet groeien in aanwezigheid van puromycine.
Verifieer de efficiëntie van de conditionele knockdown in de puromycine-resistente HCT-116 colonkankercellen en MDA-MB-231 borstkankercellen door medium met verschillende concentraties doxycycline toe te voegen en de cellen gedurende 72 uur te cultiveren.