JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 3:51 min • August 31st, 2026
Neem lentivirale vectoren die HIV-1 p24-antigeen bevatten, een eiwitmarker die wordt gebruikt voor detectie.
Voeg een detergent toe om p24 te lyseren en vrij te maken, en verdun vervolgens het monster in een seriële verdunningsreeks.
Gebruik een microplaat die is gecoat met anti-p24 monoklonale antilichamen en een blokkeringsmiddel om aspecifieke binding te voorkomen.
Voeg de monsterverdunningen en p24-standaarden als referenties toe.
Incubeer om de interactie van p24 met de antilichamen via een specifiek epitoop mogelijk te maken en verwijder vervolgens de ongebonden componenten.
Incubeer met anti-p24 polyklonale antilichamen die binden aan verschillende epitopen op p24. Verwijder alle ongebonden antilichamen.
Voeg peroxidase-gekoppelde antilichamen toe die binden aan de polyklonale antilichamen. Verwijder ongebonden antilichamen.
Voeg een peroxidase-substraat toe dat wordt omgezet in een gekleurd product.
Voeg een zuur toe om de peroxidase te inactiveren en het product te stabiliseren.
Meet de absorptie die overeenkomt met de kleurintensiteit, welke proportioneel is aan de p24-concentratie.
Maak de standaardgrafiek en schat de monsterconcentraties om de virale titer te bepalen.
Coat een high-binding 96-well plaat met 10 µL monoklonaal anti-p24 antilichaam bij een verdunning van 1:1500 volgens het NIH AIDS-vaccinprogramma voor de HIV-1 p24 antigeen-capture assay kit. Incubeer de plaat overnight bij 4 °C. Was de volgende dag de plaat drie keer met 20 µL 0,05% TWEEN-20 in koude PBS.
Om aspecifieke binding te voorkomen, wordt de plaat geblokkeerd met 200 µL 1% runder serumalbumine gedurende één uur bij kamertemperatuur. Was de plaat vervolgens drie keer met 20 µL 0,05% TWEEN-20 in koud PBS. Bereid daarna de geconcentreerde en niet-geconcentreerde vector-monsters tot een eindconcentratie van 10% door de vector te verdunnen met dubbel gedestilleerd water en Triton X-10.
Bereid vervolgens de HIV-1 standaarden voor met behulp van een tweevoudige seriële verdunning, beginnend bij 5 ng/mL. Pipetteer de verdunde geconcentreerde en niet-geconcentreerde vectorstalen in triplicaten op de plaat en incubeer deze gedurende de nacht bij 4 °C. Was de volgende dag de plaat en voeg vervolgens 100 µL polyklonaal konijn anti-p24 antilichaam toe aan elke plaat en incubeer bij 37 °C gedurende vier uur.
Incubeer de plaat na zes wasbeurten één uur lang bij 37 °C met geiten anti-konijn horseradish peroxidase. Incubeer de plaat na meerdere wasbeurten 15 minuten bij kamertemperatuur met TMB-peroxidase substraat. Voeg 1 N zoutzuur toe om de reactie te stoppen. Meet vervolgens de absorbentie bij 450 nm met een absorbance plate reader.