JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 2:44 min. • August 31st, 2026
Begin met een mengsel van plasmiden gesuspendeerd in een voedingsmedium.
Het eerste plasmide draagt een recombinant adeno-geassocieerd virus (AAV) genoom dat het gen van interesse codeert.
Het tweede plasmide codeert voor de Rep- en Cap-eiwitten.
Het derde plasmide codeert voor helper-eiwitten.
Voeg een transfectiemiddel toe aan de plasmidoplossing. Meng goed en incubeer.
Het positief geladen transfectiemiddel bindt aan het negatief geladen plasmid DNA, waardoor complexen worden gevormd.
Voeg de complexen toe aan een monolaag van zoogdiercellen. Incubeer.
De complexen dringen de cellen binnen via endocytose.
Binnen de cellen stimuleren de in het plasmide gecodeerde genen de expressie van virale eiwitten.
Het Rep-eiwit repliceert het virale genoom, terwijl de Cap-eiwitten de kapsidewanden vormen.
Het Rep-eiwit verpakt, samen met helper-eiwitten, het gerepliceerde virale genoom in capsiden, waardoor volledige AAV-partikels worden gevormd.
De recombinante AAV-vectoren die het gen van belang dragen, zijn gereed voor toepassingen in genoverdracht.
Nadat de rAAV9-constructen zijn gegenereerd en de HEK293-cellen volgens het tekstprotocol zijn gekweekt, combineert u voor de transfectie van de cellen op dag één 70 microgram AAV Rep-Cap-plasmide, 70 microgram rAAV9-plasmide en 20 microgram Ad-helper-plasmide in een centrifugebuis van 50 milliliter. Voeg 49 milliliter DMEM op kamertemperatuur zonder FBS toe aan de buis en meng dit goed. Voeg vervolgens 1.360 microliter PEI toe aan de buis en meng goed om een PEI-tot-DNA-oplossing met een ratio van vier-op-één te verkrijgen.
Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 15 tot 30 minuten. Voeg na de incubatie vijf milliliter van de oplossing toe aan elke 150-mm schaal met cellen. Kweek de cellen bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 50 tot 72 uur.