Zuivering van recombinante viruspartikels uit getransfecteerde menselijke niercellen

Begin met een cellysaat dat cellulair DNA bevat dat is geaggregeerd met cellulaire eiwitten en virale deeltjes.

Voeg magnesiumionen toe, gevolgd door een nuclease, om de enzymatische afbraak van cellulair DNA te activeren en DNA-eiwitaggregaten op te breken.

Centrifugeer om het residu te scheiden en verzamel het supernatant dat de viruspartikels bevat.

Breng het supernatant voorzichtig aan op een discontinu iodixanolgradiënt met concentraties die van boven naar beneden toenemen, en vul de buis vervolgens aan met buffer.

Ultracentrifuge om de componenten op basis van dichtheid te scheiden. Virusdeeltjes hopen zich op bij de interface tussen de lagen met hoge en medium dichtheid.

Plaats een naald bij deze interface en verzamel de virusdeeltjes in een buis.

Voeg een buffer toe die stabiliserende componenten bevat, wat aggregatie van virale deeltjes voorkomt.

Overbreng vervolgens de oplossing naar een buis met een membraanfilter.

Centrifugeer om de virale deeltjes boven het filter te concentreren.

Voeg de met stabiliseringsmiddel aangevulde buffer toe en centrifugeer opnieuw om gezuiverde virale deeltjes te verkrijgen.

Om de getransfecteerde cellen te oogsten, worden de cellen losgemaakt en gesuspendeerd door met het kweekmedium herhaaldelijk op en neer te pipetteren. Draag de celsuspensies vervolgens over naar steriele buizen van 50 milliliter. Centrifugeer de cellen gedurende vijf minuten bij 500 ×g.

Voeg vervolgens vijf milliliter PBS toe aan elke buis en resuspendeer de celpellets voordat alle suspensies worden samengevoegd in één buis van 50 milliliter. Na het centrifugeren van de cellen bij 500 ×g gedurende vijf minuten, wordt het supernatant weggegooid. Om het AAV te zuiveren, wordt de pellet geresuspendeerd in 10 milliliter lysisbuffer.

Bevries het lysaat bij -80 °C of in een bad van droogijs en ethanol. Ontdooi het vervolgens bij 37 °C. Vortex het lysaat gedurende één minuut voordat u het vriezen en ontdooien nog twee keer herhaalt.

Voeg vervolgens één millimol magnesiumchloride toe aan het ontdooide lysaat. Voeg daarna nuclease toe tot een eindconcentratie van 250 units per milliliter. Incubeer de oplossing 15 minuten bij 37 graden Celsius om de DNA-eiwitaggregatie op te lossen.

Centrifugeer het monster bij 4.800 ×g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Verzamel vervolgens het supernatant. Bereid ondertussen een 17% iodixanol-gradiëntoplossing door vijf milliliter 10X PBS te mengen met 0,05 milliliter één molar magnesiumchloride, 0,125 milliliter één molar kaliumchloride, 10 milliliter vijf molar natriumchloride en 12,5 milliliter dichtheidsgradiëntmedium.

Gebruik water om het totale volume aan te vullen tot 50 milliliter. Nadat de gradiëntoplossingen van 25%, 40% en 60% zijn bereid volgens het tekstprotocol, wordt met een naald en spuit vijf milliliter van de 17% gradiëntoplossing in een polypropyleenbuis geladen. Voeg hier vervolgens telkens vijf milliliter van de 25%, 40% en 60% gradiëntoplossingen aan toe.

Breng het lysaat voorzichtig aan bovenop de gradiënt. Vul de buis vervolgens aan met lysisbuffer en sluit deze af met een kurk. Centrifugeer de gradiënt bij 185.000 ×g en 16 °C gedurende 90 minuten.

Gebruik na het centrifugeren een injectiespuit om de 40% virale fractie te oogsten door een naald met gauge 21 in de overgang tussen de 40% en 60% fracties te steken, waarbij de 25% laag volledig wordt vermeden. Meng de virale fractie met gesteriliseerde polyoxyethyleen-polyoxypropyleen, of PEG-PPG blokcopolymeer PBS-oplossing, tot een totaal volume van 15 milliliters. Breng het mengsel over in een filterbuis met een molecuulgewicht-cutoff van 100 kilodaltons.

Centrifugeer het monster vervolgens bij 2.000 ×g en vier graden Celsius gedurende 30 minuten. Giet de vloeistof vanuit de onderkant van de buis af. Vul de filterbuis vervolgens bij tot 15 milliliters met PEG-PPG.

Centrifugeer de buis bij 2.000 ×g en vier graden Celsius gedurende 20 minuten. Nadat het opnieuw vullen en centrifugeren nog twee keer is herhaald, wordt de gezuiverde rAAV9-virusfractie die zich nog boven het filter bevindt, opgevangen.