JoVE Encyclopedie van Experimenten
Microbiologie
0 weergaven • 3:07 min. • August 31st, 2026
Neem een medium dat retrovirale particles bevat die virale oncogenen en een antibioticaresistentiegen coderen.
Centrifugeer het medium om celresten te verwijderen.
Verzamel het supernatant dat de virale deeltjes bevat en breng dit aan over een cultuur van endotheelcellen.
Incubeer om virale entry mogelijk te maken.
Het virale RNA wordt reverse getranscribeerd naar DNA, dat integreert in het genoom van de gastheer.
Het antibioticumresistentiegen produceert een resistentie-eiwit. De oncogenen produceren eiwitten die binden aan tumoronderdrukkende eiwitten die de celdeling controleren en deze inactiveren, waardoor de levensduur van de cel wordt verlengd.
Vervang het medium door vers medium.
Incubeer opnieuw om een stabiele integratie van het viraal DNA te waarborgen.
Verwijder het medium en was de cellen.
Voeg een enzymatische dissociatie-oplossing toe om de cellen los te maken.
Breng de celsuspensie over, centrifugeer en verwijder het supernatant.
Resuspendeer de pellet en breng deze over naar een kolf.
Voeg een antibioticum toe aan het medium.
Alleen cellen die het antibioticaresistentie-eiwit tot expressie brengen overleven, waardoor cellen die zijn geïmmortaliseerd door virale oncogene eiwitten worden geselecteerd.
Verzamel na een incubatie van één nacht het medium van de PA317-celcultuur en klaarden dit op door centrifugatie bij 300 × g gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Vervang het EGM-medium van de 50% confluente endotheelcelcultuur door 12 mL van het geklaarde PA317-medium. Incubeer de cellen gedurende vier uur.
Vervang vervolgens zes milliliter van het PA317-medium door zes milliliter vers EGM-medium en incubeer de cellen gedurende de nacht. Verwijder daarna het medium uit de endotheelcelcultuur en voeg 12 milliliter vers EGM toe aan de cellen. Incubeer de cellen gedurende nog eens 48 uur.
Om endotheliale cellen te subcultureren, verwijdert u het medium en wast u de cellen met 12 mL kationvrije PBS. Voeg vervolgens drie mL van een commerciële enzymatische dissociatie-oplossing toe en incubeer de cellen gedurende drie minuten bij 37 °C. Breng de celsuspensie over naar een conische buis van 15 mL en centrifugeer de cellen 5 min bij 300 ×g bij kamertemperatuur.
Zodra de cellen zijn gepelleteerd, resuspendeer deze in vers EGM-medium en verdeel de suspensie gelijkmatig over drie T75-flasks. Pas het volume van de culturen aan naar 12 milliliters EGM per flask. Voeg vervolgens 200 micrograms per milliliter G418 toe om de getransduceerde endotheelcellen te selecteren.