Bepaling van de virale RNA-distributie in gastheercellen via fluorescentie in situ hybridisatie

Begin met een objectglas met permeabiliseerde, virus-geïnfecteerde gastcellen, waarbij virale RNA's verdeeld zijn over de nucleaire en cytoplasmatische compartimenten.

Voeg een prehybridisatiebuffer toe en incubeer onder vochtige omstandigheden.

In de buffer blokkeren blokkeringsreagentia aspecifieke bindingsplaatsen, terwijl RNase-remmers RNases inactiveren en de integriteit van het RNA behouden.

Verwijder de buffer en voeg gedenatureerde, digoxigenine-gelabelde oligonucleotide probes toe die complementair zijn aan het virale RNA.

Incubeer in het donker om hybridisatie van de probe met het RNA mogelijk te maken, en was vervolgens herhaaldelijk.

Voeg een fixatief toe om de probe-RNA-hybriden te stabiliseren en was vervolgens herhaaldelijk. Voeg een buffer aan met detergent toe om de celpermeabiliteit te behouden.

Voeg een met een groen fluorofoor geconjugeerd anti-digoxigenine-antilichaam toe dat interacteert met digoxigenine, en was vervolgens herhaaldelijk.

Fixeer de cellen om de complexen te behouden en was ze vervolgens opnieuw.

Voeg een DNA-bindende kleurstof toe om de kernen te kleuren. Was het overschot aan kleurstof herhaaldelijk uit.

Monteer met een dekglas en verzegel dit.

Visualiseer onder een confocale microscoop de groene fluorescentie, die de distributie van viraal RNA tussen de celkern en het cytoplasma van de gastheercel weerspiegelt.

Na drie PBS-wassingen zoals gedemonstreerd, fixeer de monsters opnieuw in 4% formaldehyde in PBS gedurende 10-15 minuten vóór een tweede permeabilisatie zoals gedemonstreerd. Dek het preparaat vervolgens af met aluminiumfolie om het fluorescentiesignaal te behouden en fotobleken te voorkomen.

Was de cellen met 2x saline sodium citrate, voordat er 45 µL hybridisatie-oplossing wordt aangebracht. Na één uur bij 37 °C in een bevochtigingskamer wordt gedestilleerd water toegevoegd aan de antisense-oligonucleotiden van belang om het denaturatievolume op 10 µL te brengen. Denatureer de oligonucleotiden bij 95 °C gedurende vijf minuten, voordat er 35 µL verse hybridisatie-oplossing per objectglas wordt toegevoegd.

Incubeer de monsters vervolgens gedurende 10-24 uur in de bevochtigingskamer bij 37 °C, afgeschermd met folie. Was de cellen de volgende dag twee keer gedurende 10 minuten met 2X saline sodium citrate bij kamertemperatuur, gevolgd door één wasbeurt in 1X saline sodium citrate gedurende 10 minuten bij 25 °C.

Na de laatste wasstap worden de cellen 10-15 minuten op ijs gefixeerd met vooraf gekoelde 4% formaldehyde in PBS, gevolgd door drie wasbeurten met verse PBS. Permeabiliseer vervolgens de monsters zoals gedemonstreerd, gevolgd door incubatie met anti-digoxigenine-FITC en vooraf gekoelde 0,1% BSA in PBS, gedurende één uur bij vier graden Celsius. Was de slides aan het einde van de incubatie drie keer met verse PBS en fixeer de monsters 10-15 minuten bij vier graden Celsius met vooraf gekoelde 4% paraformaldehyde in PBS.

Na drie wasbeurten in PBS worden de kernen gelabeld met 0,4 µg/ml DAPI en vooraf gekoelde 0,5% Triton-X in PBS gedurende 15 minuten op ijs, gevolgd door drie laatste wasbeurten in PBS. Monteer de preparaten met fluorescentiebeads, indien experimenteel relevant, in een geschikt montagemedium. Verwijder het overtollige montagemedium met steriele doekjes, verzegel een dekglas op elk preparaat met meerdere lagen transparante nagellak en gebruik een fluorescentiemicroscoop om de succesvolle uitvoering van het experiment te bevestigen.

Vervolgens kunnen er beelden worden gemaakt met een confocale microscoop om beelden van de monsters te verzamelen binnen een uur tot een week na het mounten, bij een vergroting van 630 keer.