Bepaling van de virale RNA-distributie in gastheercellen via fluorescentie in situ hybridisatie

Begin met een objectglas met permeabiliseerde, virus-geïnfecteerde gastcellen, waarbij virale RNA's verdeeld zijn over de nucleaire en cytoplasmatische compartimenten.

Voeg een prehybridisatiebuffer toe en incubeer onder vochtige omstandigheden.

In de buffer blokkeren blokkeringsreagentia aspecifieke bindingsplaatsen, terwijl RNase-remmers RNases inactiveren en de integriteit van het RNA behouden.

Verwijder de buffer en voeg gedenatureerde, digoxigenine-gelabelde oligonucleotide probes toe die complementair zijn aan het virale RNA.

Incubeer in het donker om hybridisatie van de probe met het RNA mogelijk te maken, en was vervolgens herhaaldelijk.

Voeg een fixatief toe om de probe-RNA-hybriden te stabiliseren en was vervolgens herhaaldelijk. Voeg een buffer aan met detergent toe om de celpermeabiliteit te behouden.

Voeg een met een groen fluorofoor geconjugeerd anti-digoxigenine-antilichaam toe dat interacteert met digoxigenine, en was vervolgens herhaaldelijk.

Fixeer de cellen om de complexen te behouden en was ze vervolgens opnieuw.

Voeg een DNA-bindende kleurstof toe om de kernen te kleuren. Was het overschot aan kleurstof herhaaldelijk uit.

Monteer met een dekglas en verzegel dit.

Visualis