Het meten van spontane faaginductie in lysogene bacteriën in de loop van de tijd

Neem een overnight-cultuur van een lysogene bacterie, waarbij de meeste cellen latent fagen-DNA bevatten dat is geïntegreerd in hun genoom.

Inoculeer het in vers medium en incubeer.

Sommige bacteriën ondergaan spontane inductie en gaan over in de lytische cyclus, waarbij het fage-DNA wordt uitgesneden, gerepliceerd en virale eiwitten worden geproduceerd.

Vers geassembleerde infectieuze fagen komen vrij via cellyse.

Verzamel cultuurmonsters op gedefinieerde intervallen.

Om levensvatbare, niet-geïnduceerde lysogenen te tellen, worden seriële verdunningen van elk monster op een agarplaat geplaatst en geïncubeerd.

Tel de kolonies om de colony-forming units (CFU's) te berekenen.

Om infectieuze fagen te tellen, brengt u dezelfde verdunningen aan op een antibioticaplaat met agar die vooraf is geënt met antibioticaresistente indicatorgastcellen. Aangezien de lysogenen gevoelig zijn voor antibiotica, kunnen alleen resistente gasten groeien.

Fagen infecteren en lyseren cellen, waarbij heldere plaques worden gevormd.

Tel de plaques om de plaque-vormende eenheden (PFU's) te berekenen. Lagere PFU's duiden op minder spontane inductiegebeurtenissen.

Zet de CFU's en PFU's uit tegen de tijd. Tijdens de vroege exponentiële fase van de bacteriële groei zijn de PFU's het laagst ten opzichte van de CFU's, wat duidt op een minimale spontane faaginductie.

Begin met het opzetten van verse lysogeen- en indicatorgastheer-culturen door de overnight-culturen in 100 milliliters LB te inoculeren in een ratio van 1:100. Incubeer bij 37 graden Celsius met schudden op 180 RPM.

Om de groei van de lysogeen te monitoren, wordt elke uur vanaf het moment van inoculatie gedurende acht uur een monster van één milliliter verzameld. Verdun de cultuur serieel door 100 microliter toe te voegen aan 900 microliter LB-medium. Vortex op de maximale snelheid en zet de verdunningsreeks voort van 10⁻¹ tot 10⁻⁹.

Spot 10 µL van de benodigde verdunning op een LB-agarplaat. Laat deze drogen en incubeer bij 30 °C gedurende 18 tot 24 uur. Tel na incubatie het aantal kolonies en bereken het aantal levensvatbare bacteriële cellen met behulp van de gegeven formule.

Voeg vervolgens 100 µL rifampicine-resistente indicatorgastcellen in de log-fase toe aan de gesmolten topagar, samen met rifampicine, om de infectieuze fage-deeltjes in de temporele monstername te tellen. Spot 10 µL van de seriële verdunning van de lysogene cultuur op de geïnoculeerde topagarlaag. Laat dit drogen en incubeer bij 37 °C gedurende 18 tot 24 uur.

Tel na incubatie het aantal plaques en bereken de infectieuze fage-deeltjes met behulp van de gegeven formule.