JoVE Encyclopedia of Experiments
Microbiologie
0 weergaven • 3:35 min • August 31st, 2026
Begin met een gefiltreerd cellysaat dat adeno-geassocieerde virus (AAV)-vectoren en contaminanten afkomstig van de gastheer bevat.
Breng het lysaat door een affiniteitskolom op basis van heparine.
De virale capside-eiwitten binden elektrostatisch aan de negatief geladen heparinegroepen.
Spoel de kolom met een buffer om unbound contaminanten te verwijderen.
Breng een buffer met detergent aan om membraanresten op te lossen.
Spoel opnieuw af met de detergentvrije buffer.
Voeg een buffer toe aangevuld met kationen om een ionische omgeving te creëren, en was vervolgens met een buffer met een gemiddelde zoutconcentratie om zwak gebonden onzuiverheden te verwijderen.
Voeg een hoog-zoutbuffer toe om de interacties tussen het capside en heparine te verbreken en de virusdeeltjes te elueren.
Verzamel de elutiefracties die verrijkt zijn met intacte virale deeltjes en breng deze over in centrifugale concentratiebuizen voorzien van filtermembranen.
Centrifugeer de buisjes om overtollige buffer te verwijderen en verzamel vervolgens de geconcentreerde virale fracties in een buisje.
Spoel het membraan met de buffer om resterende virusdeeltjes terug te winnen en de opbrengst te maximaliseren.
Ontdooi het ruwe lysaat gedurende de nacht bij vier graden Celsius.
Zodra het is ontdooid, dient u het te filteren met een 0,2 micron filter. Direct voorafgaand aan de zuiveringsstappen passiveert u de centrifugale concentrator door vier milliliter filter-voorbehandelingsbuffer toe te voegen voor elke gebruikte heparin-Sepharose kolom. Plaats de slang in een peristaltische pomp.
Voer de oplossingen en media opeenvolgend uit. Bereid de chromatografie voor door een heparin-Sepharose-kolom van vijf milliliter aan de slang te bevestigen en 25 milliliters Bazell DMEM door de kolom te leiden. Laad vervolgens 0,2 micromolair van het gefilterde ruwe lysaat op de kolom bij een stroomsnelheid van één tot twee druppels per seconde.
Was de kolom opeenvolgend om vijf maal vijf milliliter 30 millimolair natriumchloride HBSS, met magnesium en calcium, te elueren, en label de vijf eluaties als E1 tot E5. Wanneer deze gereed zijn, centrifugeer de centrifugale concentrator met de voorbehandelingsbuffer bij 90 ×g gedurende twee minuten. Verwijder het doorstroomvolume. Was het filter van de centrifugale concentrator met vier milliliter HBSS met magnesium en calcium door te centrifugeren bij 10 ×g gedurende twee minuten.
Voeg vervolgens de elutie E2 toe aan de centrifugale concentrator en centrifugeer 5 minuten bij 100 ×g. Gooi het doorstroomvolume weg. Centrifugeer op dezelfde wijze de elutie E3 in de centrifugale concentrator totdat het geconcentreerde virus ongeveer één milliliter bedraagt.
Verwijder het geconcentreerde virus uit de centrifugale concentrator met een P20 gefilterde tip en verzamel dit in een steriele centrifugebuis van 1,5 milliliter. Spoel na het verzamelen van het virus de centrifugale concentrator met 20 microliters HBSS met magnesium en calcium. Pipetteer 30 seconden lang krachtig op en neer om al het aan het membraan gehechte virus los te maken en verzamel het geconcentreerde virus in dezelfde centrifugebuis van 1,5 milliliter.
Meng de buis goed.