Lentivirale vector-gebaseerde transductie van bevruchte rattenembryo's

Neem een microinjectieschaaltje met in het midden een druppel embryo-kweekmedium, bedekt met minerale olie om verdamping te voorkomen.

Plaats de schaal onder een omgekeerde microscoop.

Plaats een microinjectiecapillair en een houdpipet op een micromanipulatie-opstelling onder de microscoop.

De microinjectiecapillair wordt gevuld met een suspensie van lentivirale vectoren die het transgen dragen.

Breng vervolgens de bevruchte rattenembryo's over naar het medium.

Fixeer een embryo met de houdpipet door zuiging toe te passen.

Breng bij een hogere vergroting de microinjectiecapillair door de extracellulaire glycoproteïnehuls van het embryo, de zona pellucida, en injecteer de lentivirale suspensie in de perivitelline ruimte.

Breng de geïnjecteerde embryo's vervolgens over naar een kweekschaal en incubeer deze.

Het virus dringt het embryo binnen en laat zijn genoom, dat het transgen bevat, vrij in het cytoplasma.

Vervolgens wordt het omgezet in DNA via reverse transcriptie en integreert het in het genoom van het embryo, waarbij het transgen wordt ingebouwd.

De getransduceerde embryo's zijn nu klaar voor verdere verwerking.

Voor micro-injectie van lentivirale vectoren onder de zona pellucida van embryo's in het ééncelstadium, gebruik een pipette puller om borosilicaatglazen micro-injectiecapillairen met een filament voor te bereiden. Voer elke keer dat het filament wordt vervangen of een nieuwe glazen capillair wordt gebruikt een Ramp-test uit om de optimale parameters in te stellen.

Gebruik vervolgens onder een biosafety laminaire flowkast een microloader-tip om ongeveer twee microliters vers ontdooide lentivirale oplossing per micro-injectiepijpet te laden. Voeg een druppel van 100 microliter M2-medium toe aan het midden van het deksel van een Petri-schaal van 60 millimeter. Bedek het medium met minerale olie en monteer de vasthoudpijpet en de met virus geladen micro-injectiecapillair op een micromanipulator.

Plaats het micro-injectieschaaltje onder een omgekeerde microscoop en breng 15 tot 20 embryo's in het ééncelstadium over naar de M2-druppel in het micro-injectieschaaltje. Leg één embryo vast met de houderpipet en gebruik een 400-voudige vergroting en de glazen capillair om de lentivirale oplossing onder de zona pellucida in de perivitelline ruimte te injecteren, waarbij de capillair na toediening van het virus een moment onder de zona pellucida wordt vastgehouden. Wanneer alle embryo's zijn geïnjecteerd, worden de geïnjecteerde cellen met een fijne pipet teruggebracht naar het kweekschaaltje, waarna het schaaltje in de celkweekincubator wordt geplaatst tot aan de implantatie.