Name: Het identificeren van de effecten van BRCA1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type BRCA1 Express (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Leer een homologe recombinatie-assay om BRCA1-varianten te testen in cellijnen met RNAi-depletie en flowcytometrie-analyse. Deze methode verbetert de betrouwbaarheid van DNA-herstelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zijn dankbaar aan de Ohio State University Comprehensive Cancer Center voor het verstrekken van financiering voor dit werk.

1. Cellijn met een geïntegreerde Recombinatie Substrate <ol><li> De HeLa cellen werden stabiel getransformeerd met PDR-GFP (plasmide 7 geschenk van M. Jasin, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center) en het onderhoud van puromycine voor de selectie van transformanten. </li><li> De cellen zijn gepasseerd in DMEM / FBS, dat 10% foetaal runderserum, 2 mM Glutamax, 1 mM natrium pyruvaat, penicilline / streptomycine (100 U / mL/0.1 mg / ml) en 1,5 ug / ml puromycine. </li></ol> De recombinatie substraat in de PDR-GFP plasmide, en in stabiele transformanten, bevat twee niet-actieve allelen van GFP (Figuur 1). Een allel is niet actief te wijten aan de opname in de coderende sequentie van het 18 bp restrictie-enzym herkenningsplaats voor I-SCEI. Expressie van I-SCEI in deze cellen zorgt voor een double-stranded DNA break (DSB). Er is een tweede allel van inactieve GFP op dit DNA, maar het gedeelte van de sequentie ervan gecorreleerd met de I-SCEI site op de eerste allel is wild-type. Deze tweede GFP allel kan functioneren als een opeenvolging donor voor homologe recombinatie reparatie van de DSB en zou resulteren in een actieve GFP allel, dat gemakkelijk wordt gedetecteerd door flowcytometrie. Als alternatief zou de DSB worden gerepareerd door niet-homologe end-joining, die de I-SCEI restrictieplaats zou vernietigen en zou resulteren in GFP-negatieve cellen. Het niveau van homologe recombinatie in een cel wordt bepaald door het tellen van het percentage GFP-positieve cellen. Deze cellijn, pHeLa-DR13-9, werd geselecteerd uit alle klonen voor nul achtergrond GFP signaal en een relatief hoog percentage GFP-positieve cellen na transfectie met de I-SCEI uiten plasmide, pCBASce. (De pCBASce en de vector-controle, pCAGGS, werden beide geleverd door M. Jasin van Memorial Sloan-Kettering Cancer Center.) De HeLa-DR13-9 cellijn is verkrijgbaar bij de auteurs op aanvraag. 2. Transfectie om Endogene BRCA1 afbreken, en Add Terug Mutant BRCA1. <ol><li> De dag voor de eerste transfectie (meestal een dinsdag): Begin met een 10 cm schotel van HeLa-DR13-9 cellen ten minste 90% confluent. </li><li> Trypsinize in 1 ml en stop de reactie door het toevoegen van 9 ml DMEM / FBS, meng goed door pipetteren. </li><li> Voeg 40 ul van getrypsiniseerd cellen per putje van een 24 wells plaat in 0,5 ml van de DME / FBS. </li><li> Dag 1 transfecties (woensdag): cellen moeten ~ 40-50% confluent zijn, als veel minder beginnen. Transfecteren door het mengen van: 5 pmol siRNA + 0,3 ug BRCA1-mutant tot expressie plasmide DNA in 12,5 ul Opti-MEM en 0,5 pi Lipofectamine 2000 in 12,5 ul Opti-MEM. Ga verder met de transfectie volgens het Lipofectamine protocol (Invitrogen). </li><li> Later vervangen door de media 4-6 uur. Het siRNA we gebruiken om BRCA1 afbreken wordt gebaseerd op de sequentie GCUCCUCUCACUCUUCAGU met vermelding van BRCA1 3'-UTR sequenties 80.780 naar 80.798 (toetreding nummer AY273801). </li><li> Dag 2: Transfer van de cellen door trypsinizing van de 24 wells plaat met een 6 wells plaat. </li><li> Dag 3 transfecties: 25 pmol siRNA + 0,75 ug BRCA1-mutant tot expressie plasmide DNA + 0,75 ug pCBASce (of pCAGGS vector controle) in 62,5 pi Opti-MEM en 2,5 pi Lipofectamine 2000 in 62,5 ul Opti-MEM. Later vervangen door de media 4-6 uur. </li></ol> 3. Analyse van de transfectanten. <ol><li> Op dag 6, trypsinize cellen uit elk putje en stoppen in 1 ml DMEM / FBS. Het analyseren van de cellen voor GFP expressie kan worden gedaan op dag 5 of 7, maar wij vinden dat de dag 6 het beste werkt. </li><li> Analyseren van 10.000 cellen per well door flowcytometrie. We maken gebruik van een Becton Dickinson FACSCalibur instrument in de Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytische Cytometry gedeelde bron. Single, levende cellen worden gated gebruik van de forward en side scatter parameters. GFP-positieve cellen worden gedetecteerd met behulp van de GFP fluorescentie detector (FL1), en de resultaten worden gepresenteerd als een histogram (figuur 2, onderaan). </li><li> Overgebleven cellen kunnen worden opnieuw uitgeplaat voor fotografie door middel van fluorescentie microscopie indien gewenst. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: BRCA1 regelt de weg voor reparatie van dubbelstrengs DNA breuken door homologe recombinatie 6,11. Die cellen die reparatie hebben ondergaan door homologe recombinatie gemakkelijk gedetecteerd door fluorescentie microscopie (figuur 2, bovenaan). Uitputting van BRCA1 resulteert in een afname van de gedetecteerde GFP-positieve cellen (figuur 2, rechts). De output van de FACSCalibur is een histogram met GFP intensiteit per cel op de X-as en het aantal cellen op de Y-as (figuur 2, onderaan). In een typische set resultaten uit een experiment, 15,5% van de cellen werden GFP-positieve nadat I-SCEI expressie en controle RNAi uitputting (figuur 3). Ter vergelijking, voeg uitputting van BRCA1 en vector weer gereduceerd GFP-conversie naar 0,7%. Add-back van de wild-type BRCA1 of van BRCA1 (I21V) volledig gerestaureerd homologe recombinatie, zoals gedetecteerd door het verkrijgen van 15-16% GFP-positieve cellen. Add-back van de BRCA1 (M18T) mutant (figuur 3, baan 5) had dezelfde strekking als de add-back van de vector te controleren. Omdat deze variant uitgesproken op een vergelijkbaar niveau als het endogene eiwit 9, we dus interpreteren de BRCA1 (M18T) variant is niet-functioneel in homologe recombinatie. We hebben meestal 10-20% van de cellen om te zetten in GFP-positief na transfectie van de I-SCEI expressieplasmide. Uitputting van BRCA1 vermindert reproduceerbaar de conversie van GFP-positieve cellen met ongeveer 8-10 maal. Hoewel de werkelijke percentages van GFP-positieve cellen kan van experiment om te experimenteren, de verhouding van GFP-positieve cellen veranderen na BRCA1 uitputting ten opzichte van de controle uitputting binnen een experiment is vrij consistent. We normaliseren resultaten door het instellen van de ongeremde succespercentage tot 100% en express resultaten met BRCA1 depleties en voeg-backs als percentages. Op deze manier kunnen we combineren meerdere experimenten, en de experimentele variatie is niet hoog. Voeg achterkant van BRCA1 mutanten tot nu toe hebben opgeleverd robuuste resultaten: elke BRCA1 variant is ofwel volledig homologe recombinatie gerestaureerd activiteiten of heeft geen effect gehad. Een belangrijke overweging bij het verkrijgen van deze resultaten is dat onze transfectie voorwaarden niveaus van BRCA1-eiwit dat ongeveer gelijk zijn aan de concentratie van het endogene eiwit in onbehandelde cellen te produceren. Een te hoog van een overexpressie van zelfs een gebrekkige mutant van BRCA1 kan leiden tot een aantal positieve homologe recombinatie activiteit. Een probleem dat we nodig hadden om te overwinnen was de toxiciteit van transfectie. Uitputting van BRCA1 zelf kunnen vertragen celgroei, en het saldo van Lipofectamine-2000 en plasmide DNA ten opzichte van het aantal cellen op de schotel moet worden gehouden op een constant niveau. Te veel Lipofectamine of plasmide-DNA zal verminderen cel nummers, en het aantal cellen zal onvoldoende zijn om betrouwbare flow cytometrie resultaten te verkrijgen. Het saldo van de plasmide en Lipofectamine reagentia ten opzichte van het aantal getransfecteerde cellen is heel belangrijk voor het behoud van de levensvatbaarheid van de cellen. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Recombinatie substraat. De strategie die was ontwikkeld door de groep van M. Jasin 7,12 is afgebeeld. De PDR-GFP plasmide bevat twee defecte allelen van GFP, waarvan het ene een I-SCEI restrictie endonuclease site. Een HeLa afgeleid cellijn bevat deze DNA-substraat geïntegreerd op een enkele plaats in het genoom 9, en actieve reparatie van de double-stranded DNA pauze op de I-SCEI site door homologe recombinatie resulteert in de omzetting van een allel voor GFP-positieve. <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Detectie van GFP-positieve cellen door fluorescentie microscopie. Cellen werden getest per dit protocol, en controle-uitgeputte cellen actief waren in homologe recombinatie, zoals gedetecteerd door een hoog percentage cellen met GFP expressie (links). Uitputting van BRCA1 door RNAi resulteert in een scherpe daling van het aantal GFP-positieve cellen (rechts). <img src="/files/ftp_upload/2468/2468fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Resultaten van een add-back van BRCA1 missense mutanten. Resultaten van een enkel experiment worden getoond in dit histogram. Bij het ontbreken van getransfecteerde I-SCEI uiten plasmide (laan 1) zijn er geen gevonden GFP-positieve cellen. De resultaten in lanen 2-6 waren allemaal afkomstig uit cellen waarin de I-SCEI expressie plasmide werd getransfecteerd op dag 3. In cellen die waren uitgeput voor een irrelevante gen (luciferase) en met vector add-back, 15,5% van de cellen werden GFP-positieve (laan 2). Uitputting van BRCA1 en vector add-back toont het effect van het verlies van BRCA1 op homologe recombinatie (laan 3). De effecten van de uitputting van BRCA1 en add-achterkant van de wild-type BRCA1 (laan 4), BRCA1 (M18T) (baan 5), en BRCA1 (I21V) (baan 6) worden weergegeven. Deze resultaten zijn afkomstig uit een enkel experiment, en zou worden gecombineerd met ten minste twee meer herhalen experimenten in om een ​​maatregel van de homologe recombinatie wordt ondersteund door een bepaalde mutant BRCA1 eiwit te verkrijgen.

<ol><li>Carvalho, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cancer+risk+associated+with+germ+line+BRCA1+missense+variants+by+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Determination of cancer risk associated with germ line BRCA1 missense variants by functional analysis.</a> Cancer Res. 67, 1494-1501 (2007).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+epidemiology+of+BRCA1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Genetic epidemiology of BRCA1.</a> Cancer Biol Ther. 3, 509-514 (2004).</li>
<li>Couch, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+functional+effects+of+unclassified+genetic+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mutat%22%5BJournal%5D)">Assessment of functional effects of unclassified genetic variants.</a> Hum Mutat. 29, 1314-1326 (2008).</li>
<li>Tomlinson, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+breast+cancer+cell+line+derived+from+a+germ-line+BRCA1+mutation+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-line BRCA1 mutation carrier.</a> Cancer Res. 58, 3237-3242 (1998).</li>
<li>Ruffner, H., Joazeiro, C. A., Hemmati, D., Hunter, T., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer-predisposing+mutations+within+the+RING+domain+of+BRCA1%3A+loss+of+ubiquitin+protein+ligase+activity+and+protection+from+radiation+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cancer-predisposing mutations within the RING domain of BRCA1: loss of ubiquitin protein ligase activity and protection from radiation hypersensitivity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 5134-5139 (2001).</li>
<li>Moynahan, M. E., Chiu, J. W., Koller, B. H., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brca1+controls+homology-directed+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Brca1 controls homology-directed DNA repair.</a> Mol Cell. 4, 511-518 (1999).</li>
<li>Nakanishi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fanconi+anemia+monoubiquitination+pathway+promotes+homologous+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human Fanconi anemia monoubiquitination pathway promotes homologous DNA repair.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1110-1115 (2005).</li>
<li>Pierce, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+breaks+and+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Double-strand breaks and tumorigenesis.</a> Trends Cell Biol. 11, 52-59 (2001).</li>
<li>Ransburgh, D. J., Chiba, N., Ishioka, C., Toland, A. E., Parvin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+breast+tumor+mutations+in+BRCA1+that+abolish+its+function+in+homologous+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of breast tumor mutations in BRCA1 that abolish its function in homologous DNA recombination.</a> Cancer Res. 70, 988-995 (2010).</li>
<li>Easton, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genetic+assessment+of+1%2C433+sequence+variants+of+unknown+clinical+significance+in+the+BRCA1+and+BRCA2+breast+cancer-predisposition+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">A systematic genetic assessment of 1,433 sequence variants of unknown clinical significance in the BRCA1 and BRCA2 breast cancer-predisposition genes.</a> Am J Hum Genet. 81, 873-883 (2007).</li>
<li>Snouwaert, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1+deficient+embryonic+stem+cells+display+a+decreased+homologous+recombination+frequency+and+an+increased+frequency+of+non-homologous+recombination+that+is+corrected+by+expression+of+a+brca1+transgene%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">BRCA1 deficient embryonic stem cells display a decreased homologous recombination frequency and an increased frequency of non-homologous recombination that is corrected by expression of a brca1 transgene.</a> Oncogene. 18, 7900-7907 (1999).</li>
<li>Pierce, A. J., Hu, P., Han, M., Ellis, N., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ku+DNA+end-binding+protein+modulates+homologous+repair+of+double-strand+breaks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Ku DNA end-binding protein modulates homologous repair of double-strand breaks in mammalian cells.</a> Genes Dev. 15, 3237-3242 (2001).</li>
<li>Spearman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinically+applicable+models+to+characterize+BRCA1+and+BRCA2+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Clinically applicable models to characterize BRCA1 and BRCA2 variants of uncertain significance.</a> J Clin Oncol. 26, 5393-5400 (2008).</li>
<li>Sweet, K., Senter, L., Pilarski, R., Wei, L., Toland, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+BRCA1+ring+finger+variants+of+uncertain+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Characterization of BRCA1 ring finger variants of uncertain significance.</a> Breast Cancer Res Treat. 119, 737-743 (2009).</li>
</ol>

Het voordeel van deze methode is dat we de functie van het BRCA1-eiwit studie in het reguleren van DNA-herstel door homologe recombinatie met behulp van cellen die wild-type endogeen tot expressie BRCA1 hebben. We hebben twee verschillende methoden voor de studie van de homologe recombinatie proces en van het gebruik van RNAi-gemedieerde uitputting van de nieuwe methode voor het testen van BRCA1-varianten voor functie bij DNA-herstel te verkrijgen. De sleutel voor het succes van deze methode was om een ​​gemakkelijk transfectable cellijn, zoals HeLa vast te stellen, met de recombinatie substraat in het genoom zodanig dat we een zeer hoge niveaus van GFP conversie te verkrijgen. We hadden gescreend meerdere klonen van de oorspronkelijke transformatie om naar een die geen detecteerbare achtergrond GFP signaal had te verkrijgen, maar op transfectie van de I-SCEI expressieplasmide had een zeer hoog niveau van GFP conversie. Met deze methode, zijn we nu onderzoek naar andere specifieke BRCA1 aminozuren voor functie in homologe recombinatie. Samen met de biologische inzichten uit dit werk, kunnen deze conclusies worden toegepast op de klinische genetica van kanker. Een hoog percentage van de BRCA1 missense mutaties onbekende klinische betekenis omdat er vele zeldzame varianten en er is onvoldoende informatie voor veel van deze vereniging om de kanker te bepalen door genetische segregatie analyse 3,10,13,14. Met behulp van deze methode zouden de gevolgen van een specifieke variant op de biologische functie van BRCA1 bij het reguleren van homologe recombinatie worden gebruikt om vrouwen die een van deze varianten dragen in hun genoom te informeren.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>11960</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>9871-5200</td><td></td></tr><tr><td>siRNA</td><td>Invitrogen</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine-2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen</td><td>12604</td><td></td></tr><tr><td>Puromycine</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>BML-GR312</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat</td><td>Invitrogen</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX I</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-Streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr></tbody></table>

het identificeren van de effecten van brca1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type brca1 express

Identifying the Effects of BRCA1 Mutations on Homologous Recombination using Cells that Express Endogenous Wild-type BRCA1

De functionele analyse van missense mutaties kan worden bemoeilijkt door de aanwezigheid in de cel van de endogene eiwit. Structuur-functie analyse van de BRCA1 werden bemoeilijkt door het ontbreken van een robuuste test voor de volledige lengte BRCA1-eiwit en de moeilijkheden die inherent zijn aan het werken met cellijnen die hypomorphic BRCA1-eiwit 1,2,3,4,5 uit te drukken. We ontwikkelden een systeem waarbij de endogene BRCA1-eiwit in een cel acuut was uitgeput door RNAi gericht op de 3&#39;-UTR van het BRCA1 mRNA en vervangen door co-transfectie een plasmide dat een BRCA1 variant. Een voordeel van deze procedure is dat de acute zwijgen van BRCA1 en gelijktijdige vervanging laat de cellen om te groeien zonder secundaire mutaties of aanpassingen die kunnen ontstaan ​​na verloop van tijd te compenseren voor het verlies van BRCA1-functie. Deze uitputting en voeg-back procedure werd gedaan in een HeLa-afgeleide cellijn die gemakkelijk werd getest op homologe recombinatie activiteit. De homologe recombinatie test is gebaseerd op een eerder gepubliceerde methode waarbij een recombinatie substraat is geïntegreerd in het genoom (Figuur 1) 6,7,8,9. Deze recombinatie substraat heeft de zeldzame-cutting I-SCEI restrictie-enzym plaats in een inactieve GFP-allel, en stroomafwaarts is een seconde inactief GFP-allel. Transfectie van het plasmide, dat I-SCEI resultaten uit in een double-stranded breken, die kan worden gerepareerd door homologe recombinatie, en als homologe recombinatie niet repareren de pauze het creëert een actieve GFP allel dat gemakkelijk wordt gescoord door flowcytometrie voor GFP eiwitexpressie . Uitputting van endogene BRCA1 resulteerde in een 8-10-voudige afname in homologe recombinatie activiteit en add-achterkant van de wild-type plasmide volledig homologe recombinatie gerestaureerd functie. Wanneer specifieke punt mutanten van volledige lengte BRCA1 werden uitgedrukt van co-getransfecteerd plasmiden, kan het effect van de specifieke missense mutant worden gescoord. Als voorbeeld, de expressie van het BRCA1 (M18T) eiwit, een variant van onbekende klinische betekenis 10, werd uitgedrukt in deze cellen, is het niet BRCA1-afhankelijke homologe recombinatie te herstellen. Daarentegen, de expressie van een andere variant, ook van onbekende betekenis, BRCA1 (I21V) volledig gerestaureerd BRCA1-afhankelijke homologe recombinatie functie. Deze strategie van het testen van de functie van BRCA1 missense mutaties is toegepast op een ander biologisch systeem te testen op centrosoom functie (Kais et al., ongepubliceerde waarnemingen). Het geheel genomen is deze aanpak is geschikt voor de analyse van missense mutanten in een gen dat recessief moet worden geanalyseerd.

Wij bieden een methode voor het testen van BRCA1 varianten in een weefselkweek gebaseerde test voor homologe recombinatie reparatie van DNA-schade door afbrekende endogene BRCA1-eiwit uit een cel met behulp van RNAi en te vervangen door een BRCA1-punt mutant die een codering wijzigen.

Het identificeren van de effecten van BRCA1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type BRCA1 Express

De functionele analyse van missense-mutaties kan worden bemoeilijkt door de aanwezigheid van het endogene eiwit in de cel. Structuur-functieanalyses van de ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het testen op specifieke varianten in het BRCA1-eiwit met behulp van een in vitro homologe recombinatie-assay. Dit wordt bereikt door het endogene wild-type BRCA1-eiwit te vervangen door de variant die wordt getest via de transfectie van zowel short interfering RNA, specifiek voor BRCA1, als een plasmide voor de re-expressie van test-BRCA1-variant-eiwitten in cellen; als tweede stap worden het short interfering RNA en het plasmide voor de expressie van mutant BRCA1 getransfecteerd, samen met een plasmide voor de expressie van het I SCE1-eiwit, dat DNA-schade veroorzaakt op een specifieke locatie in het DNA-genoom van de testcel. Vervolgens worden de cellen twee tot drie dagen geïncubeerd om DNA-schade en herstel mogelijk te maken; er worden resultaten verkregen die aantonen of specifieke eiwitvarianten van het BRCA1-eiwit functioneren bij DNA-herstel door homologe recombinatie, gebaseerd op flowcytometrie-analyse van GFP-exprimerende cellen.Deze techniek combineert twee gevestigde methoden om een veelzijdig systeem te creëren voor het analyseren van specifieke eiwitvarianten bij de herstelling van DNA-schade door homologe recombinatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat eerder gevestigde methoden steunden op cellijnen met een genetische knockout van BRCA1. Wij maken gebruik van een beter hanteerbare cellijn afgeleid van HELOC-cellen, die de depletie van BRCA1 mogelijk maakt via RNA-interferentie van het endogene eiwit, gevolgd door het terugvoegen van het testeiwit in deze cellen.Nu we een variant van het BRC1-eiwit tot expressie brengen, kunnen we testen op homologe recombinatie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege overmatige celdood tijdens de procedure. Het is belangrijk om de transsectiecondities zorgvuldig in te stellen, zodat het effect van de recombinatiereactie wordt gemaximaliseerd terwijl de cytotoxiciteit wordt beperkt.Voorafgaand aan de start van dit protocol werd de hela DR 13 nine-cellijn gevestigd door hela-cellen te transfecteren met P-D-R-G-F-P. De cellijn wordt onderhouden op Petri-schalen van 10 centimeter in purmycine voor selectie van stabiel getransfecteerde cellen. Het recombinatiesubstraat in het P-D-R-G-F-P-plasmide en in de stabiele transformanten bevat twee inactieve allelen van GFP. Eén allel is inactief vanwege de aanwezigheid van de restrictie-enzymherkenningsplaats van 18 baseparen voor ISCE one.In de coderende sequentie zorgt de expressie van ISCE one in deze cellen voor een dubbelstrengs DNA-breuk of DSB op het tweede allel van inactief GFP. Het deel van de sequentie dat correleert met de I SCE E one-site op het eerste allel is wild-type. Dit tweede GFP-allel kan fungeren als sequentiedonor voor homologe recombinatiereparatie van de DSP, wat zou resulteren in een actief GFP-allel, dat de dag vóór de eerste transfectie eenvoudig kan worden aangetoond via flowcytometrie.Neem een schaal van 10 centimeter met HeLa DR 13-cellen die ten minste 90% confluent zijn. Trypsiniseer de cellen in 1 milliliter gedurende twee tot drie minuten. Stop de reactie door 9 milliliter DMEM-FBS toe te voegen en meng de cel-suspensie goed door te pipetteren. Voeg 40 microliters van de getrypsiniseerde cellen per putje van een 24-wells plaat toe in 0,5 milliliter DMEM-FBS. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2.Op dag één moeten de cellen een confluentie van tussen 40 en 50% hebben. Begin de transfectie door zowel het irna om endogeen b RCA one te depleteren als het B RCA one mutant-expressieplasmid in optimum media te mengen. Combineer vervolgens de nucleïnezuren met lip in optimum media.Voer de lipectomie-transfectie uit volgens de instructies van de fabrikant na de transfectie. Plaats de cellen terug in de incubator. Vervang het medium vier tot zes uur later door medium dat geen antibiotica bevat.Plaats de cellen op de tweede dag terug om een nacht te incuberen. Trypsiniseer de cellen door 0,3 milliliters TrypLE trypsin-reagens aan elke well toe te voegen. Na een korte incubatie bij 37 degrees Celsius worden de cellen losgemaakt door ze met een pipet herhaaldelijk op en neer te zuigen in het trypsin-reagens. Zodra de trypsinisering voltooid is, worden de cellen vanuit de 24-wells plaat overgebracht naar een 6-wells plaat met twee milliliters D-M-E-M-F-B-S om de trypsin-activiteit te stoppen.Laat de zes-wellplaat overnacht incuberen onder dezelfde omstandigheden als voorheen, twee dagen na de initiële transfectie. Bereid de SIR A, het BRCA1-mutant-expressie-plasmide DNA en het ISCE1-expressie-plasmide voor in 62,5 µL Optum. Meng deze oplossing met 2,5 µL LIPECTOMY 2060 en 2,5 µL Optum.Ga over tot transfectie van de cellen na een incubatie van vier tot zes uur. Vervang het medium door D-M-E-M-F-P-S zonder antibiotica. Plaats de cellen op dag zes terug in de incubator.Trypsiniseer de cellen in elke well door 0,5 milliliters trypsin-reagens toe te voegen. Stop de reactie door twee milliliters D-M-E-M-F-B-S toe te voegen en verzamel de cellen door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in één milliliter vers D-M-E-M-F-B-S en analyseer 10.000 cellen per well op GFP-expressie.Via flowcytometrie worden individuele levende cellen geselecteerd aan de hand van forward scatter- en size scatter-parameters. GFP-positieve cellen worden geïdentificeerd met de GFP-fluorescentiedetector en de resultaten worden weergegeven als een histogram. De overige cellen kunnen opnieuw worden uitgeplaat voor fluorescentiefotografie.Microscopie van het gewenste BRCA1 reguleert de route voor herstel van dubbelstrengs DNA-breuken via homologe recombinatie. Cellen die herstel via homologe recombinatie hebben ondergaan, zijn eenvoudig te detecteren met fluorescentiemicroscopie. Depletie van BRCA1 door RNAi resulteert in een scherpe afname van de gedetecteerde GFP-positieve cellen.De output van de FCA is een histogram met de GFP-intensiteit per cel op de x-as en het aantal cellen op de y-as. In afwezigheid van getransfecteerde, I SCE één expressieplasmid. Er worden geen GFP-positieve cellen gedetecteerd.De resultaten in kolom twee tot en met zes zijn allemaal afkomstig van cellen waarin het ISC-één-expressieplasmide op dag drie was getransfecteerd. In een typische set resultaten van een enkel experiment zijn 15,5% van de cellen GFP-positief na ISC-één-expressie en controle-RNAi-depletie voor een irrelevant gen; ter vergelijking reduceert depletie van BRCA-één en het terugvoegen van een leeg plasmide-vector de GFP-conversie tot 0,7%. Toevoeging van exogeen wildtype BRCA-één herstelde de homologe recombinatie volledig, zoals aangetoond door het verkrijgen van 15 tot 16% GFP-positieve cellen.Op soortige wijze werd de expressie van een andere variant met onbekende significantie, de BRCA1 21B-mutatie, volledig hersteld. De BRCA1-afhankelijke homologe recombinatiefunctie vertoonde na toevoeging van de BRCA1 M18T-mutant een vergelijkbaar effect als bij de vectorcontrole.Aangezien deze variant op vergelijkbare niveaus werd tot expressie gebracht als het endogene eiwit, suggereert dit dat de BRCA1 M18T-variant niet functioneel is bij homologe recombinatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de groei van de cellen te bewaken; de cellen groeien langzaam en bij een lage confluentie, waardoor de hoeveelheid gebruikte transfectiemengsel moet worden verminderd. Het is tevens belangrijk om het transfectiemedium tijdig te verwijderen.We stellen vast dat er in de dagen na transfectie een hoge mate van cytotoxiciteit optreedt als er antibiotica in het medium zijn opgenomen. Om deze reden bevat al het medium na de eerste dag geen antibiotica meer. Na de ontwikkeling van deze techniek kregen onderzoekers op het gebied van borstkankeronderzoek de mogelijkheid om de genetica van BRCA1-varianten met onbekende klinische significantie in kankerclinieken te bestuderen.We hopen dat de functionele BRC one-assay die in dit werk is ontwikkeld, zal bijdragen aan een verbeterde voorspelling van de effecten van BRC one-varianten op de aanleg voor kanker.

identifying-effects-brca1-mutations-on-homologous-recombination-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

gDNA-verrijking voor NGS-sequencing is een eenvoudig en krachtig hulpmiddel voor de studie van constitutionele mutaties. In dit artikel presenteren we de procedure om eenvoudig de volledige sequentie van 11 genen te analyseren die betrokken zijn bij DNA-schadeherstel.

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen

Genstilzwijging door siRNA vertegenwoordigt een handige experimentele strategie om BRCA2-afhankelijke biologische functies te analyseren met directe implicaties om de kankerbiologie beter te begrijpen. Een methode om BRCA2 efficiënt te stilzwijgen, samen met de experimentele procedure om veranderingen in BRCA2-eiwitexpressie te detecteren en te kwantificeren door immunoblotting in humane cellijnen, wordt gepresenteerd.

Silencing van<em&gt; BRCA2</em&gt; Naar Novel-BRCA2 geregeld biologische functies Identificeer in gekweekte menselijke cellen

Dit protocol beschrijft de workflow van een CRISPR/Cas9 gebaseerde gen bewerken systeem voor de reparatie van puntmutaties in zoogdiercellen. Hier, gebruiken wij een combinatorische benadering voor het gen bewerken met een gedetailleerde opvolgzuigelingenvoeding experimentele strategie voor het meten van indel vorming op de doelsite — Kortom, het analyseren van on-site mutagenese.

Een standaard methodiek te onderzoeken ter plaatse mutageniteit als een functie van punt mutatie reparatie gekatalyseerd door CRISPR/Cas9 en SsODN in menselijke cellen

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Mensen met BRCA1-mutaties hebben een hoger risico op het ontwikkelen van kanker, wat een nauwkeurige evaluatie van de functie van BRCA1-varianten garandeert. Hierin beschreven we een protocol voor functionele beoordeling van BRCA1-varianten met behulp van CRISPR-gemedieerde cytosinebasiseditors die gerichte C:G naar T:A-conversie in levende cellen mogelijk maken.

Functionele beoordeling van BRCA1-varianten met CRISPR-gemedieerde basiseditors

In dit protocol laten we zien hoe dna dubbelstrengs eindresectie tijdens de S/G2-fase van de celcyclus kan worden gevisualiseerd met behulp van een op immunofluorescentie gebaseerde methode.

Beoordeling van wereldwijde DNA double-strand eindresectie met behulp van BrdU-DNA-labeling in combinatie met cell cycle discrimination imaging

Hier gepresenteerd is sgRNA / CAS9 endonuclease en next-generation sequencing protocol dat kan worden gebruikt om de mutaties te identificeren die geassocieerd zijn met dubbelstrengs breukherstel in de buurt van de CD4-promotor.

Next Generation Sequencing gebruiken om mutaties te identificeren die verband houden met reparatie van een cas9-geïnduceerde dubbelstrengsbreuk in de buurt van de CD4-promotor

Dit protocol beschrijft een extrachromosomale niet-homologe eindverbindingstest (NHEJ) en een homologe recombinatietest (HR) om de efficiëntie van NHEJ en HR in HEK-293T-cellen te kwantificeren.

Analyse van niet-homologe eindverbindingen en homologe recombinatie-efficiëntie in HEK-293T-cellen met behulp van op GFP gebaseerde reportersystemen

Dit protocol is ontworpen om de omvang van DNA-schade te onderzoeken die optreedt tijdens DNA-replicatie. Onder neutrale omstandigheden kan de inductie van DNA-breuken gemakkelijk binnen een kort tijdsbestek worden beoordeeld. Bovendien is het protocol aanpasbaar aan andere celtypen en verschillende replicatiestressreagentia.

Detectie van DNA-breuken in delende menselijke cellen door neutrale komeettest

Leer een homologe recombinatie-assay om BRCA1-varianten te testen in cellijnen met RNAi-depletie en flowcytometrie-analyse. Deze methode verbetert de betrouwbaarheid van DNA-herstelonderzoek.

Het identificeren van de effecten van BRCA1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type BRCA1 Express (Video) | JoVE Journal

Het identificeren van de effecten van BRCA1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type BRCA1 Express

Meer video's verkennen