Het identificeren van de effecten van BRCA1 mutaties op homologe recombinatie met behulp van cellen dat endogene wild-type BRCA1 Express

Het algemene doel van het volgende experiment is het testen op specifieke varianten in het BRCA1-eiwit met behulp van een in vitro homologe recombinatie-assay. Dit wordt bereikt door het endogene wild-type BRCA1-eiwit te vervangen door de geteste variant via de transfectie van zowel short interfering RNA, specifiek voor BRCA1, als een plasmide voor de herexpressie van de geteste BRCA1-variant-eiwitten in cellen; als tweede stap worden het short interfering RNA en het plasmide voor expressie van mutant BRCA1 getransfecteerd, samen met een plasmide voor de expressie van het ICN1-eiwit, dat DNA-schade veroorzaakt op een specifieke locatie in het DNA-genoom van de testcel. Vervolgens worden de cellen twee tot drie dagen geïncubeerd om DNA-schade en herstel mogelijk te maken; de resultaten tonen aan of specifieke eiwitvarianten van het BRCA1-eiwit functioneren bij DNA-herstel via homologe recombinatie, op basis van flowcytometrie-analyse van GFP-expresserende cellen.

Deze techniek combineert twee gevestigde methoden om een veelzijdig systeem te creëren voor het analyseren van specifieke eiwitvarianten bij het herstel van DNA-schade door homologe recombinatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat eerder gevestigde methoden steunden op cellijnen met een genetische knockout van BRCA1. Wij maken gebruik van een hanteerbaardere cellijn afgeleid van HELOC-cellen, die de depletie van BRCA1 mogelijk maakt door RNA-interferentie van het endogene eiwit en de add-back van het testeiwit in deze cellen.

Nu we een variant van het BRC1-eiwit tot expressie brengen, kunnen we testen op homologe recombinatie. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben vanwege overmatige celdood tijdens de procedure. Het is belangrijk om de transectiecondities zorgvuldig in te stellen om het effect van de recombinatiereactie te maximaliseren en tegelijkertijd de cytotoxiciteit te beperken.

Voorafgaand aan de start van dit protocol werd de hela DR 13 nine cellijn gevestigd door hela-cellen te transfecteren met P-D-R-G-F-P. Onderhoud de cellijn op Petri-schalen van 10 centimeter in purmycine voor selectie van stabiel getransfecteerde cellen. Het recombinatiesubstraat in het P-D-R-G-F-P plasmide en in de stabiele transformanten bevat twee inactieve allelen van GFP. Eén allel is inactief vanwege de aanwezigheid van de restrictie-enzymherkenningsplaats van 18 basenparen voor ISCE one.

In de coderende sequentie zorgt de expressie van ISCE one in deze cellen voor een dubbelstrengs DNA-breuk of DSB op het tweede allel van inactief GFP. Het deel van de sequentie dat correleert met de I SCE E one-site op het eerste allel is wild-type. Dit tweede GFP-allel kan fungeren als sequentiedonor voor homologe recombinatiereparatie van de DSP, wat zou resulteren in een actief GFP-allel, dat de dag voor de eerste transfectie gemakkelijk kan worden gedetecteerd via flowcytometrie.

Neem een schaal van 10 centimeter met HeLa DR 13-cellen die ten minste 90% confluent zijn. Trypsineer de cellen in 1 milliliter gedurende twee tot drie minuten. Stop de reactie door 9 milliliter DMEM-FBS toe te voegen en meng de celsuspensie goed door te pipetteren. Voeg 40 microliter getrypsineerde cellen per putje van een 24-wells plaat toe in 0,5 milliliter DMEM-FBS. Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 °C en 5% CO2.

Op dag één moeten de cellen een confluentie van tussen de 40 en 50% hebben. Begin de transfectie door zowel het irna om endogeen b RCA one te depleteren als het plasmide dat het B RCA one-mutant tot expressie brengt te mengen in optimum media. Combineer vervolgens de nucleïnezuren met lip in optimum media.

Voer de lipectomie-transfectie uit volgens de instructies van de fabrikant na de transfectie. Plaats de cellen terug in de incubator. Vervang het medium vier tot zes uur later door medium dat geen antibiotica bevat.

Plaats de cellen op de tweede dag terug voor incubatie gedurende de nacht. Behandel de cellen met trypsine door 0,3 milliliters trypsine-reagens aan elke put toe te voegen. Maak de cellen na een korte incubatie bij 37 degrees Celsius los door de cellen met een pipet op en neer te zuigen in het trypsine-reagens. Zodra de trypsine is gewerkt, worden de cellen van de 24-putsplaat overgebracht naar een 6-putsplaat met twee milliliters D-M-E-M-F-B-S om de trypsine-activiteit te stoppen.

Laat de zes-wells plaat overnacht incuberen onder dezelfde omstandigheden als voorheen, twee dagen na de initiële transfectie. Bereid het SIR A, het BRCA1-mutant-expressieplasmide-DNA en het ISCE1-expressieplasmide voor in 62,5 µL Optum. Meng deze oplossing met 2,5 µL LIPECTOMY 2060 en 2,5 µL Optum.

Ga over tot het transfecteren van de cellen na een incubatie van vier tot zes uur. Vervang het medium door D-M-E-M-F-P-S zonder antibiotica. Plaats de cellen op dag zes terug in de incubator.

Trypsiniseer de cellen in elke well door 0,5 milliliters trypsine-reagens toe te voegen. Stop de reactie door twee milliliters D-M-E-M-F-B-S toe te voegen. Verzamel de cellen door centrifugatie bij 1000 RPM gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in één milliliter vers D-M-E-M-F-B-S en analyseer 10.000 cellen per well op GFP-expressie.

Via flowcytometrie worden individuele levende cellen geselecteerd met behulp van parameters voor forward scatter en size scatter. GFP-positieve cellen worden aangestuurd via de GFP-fluorescentiedetector en de resultaten worden gepresenteerd als een histogram. De overige cellen kunnen opnieuw worden geplaat voor fluorescentiefotografie.

Microscopie van het gewenste BRCA1 reguleert de route voor de herstel van dubbelstrengs DNA-breuken door homologe recombinatie. Cellen die herstel door homologe recombinatie hebben ondergaan, zijn eenvoudig te detecteren met fluorescentiemicroscopie. Depletie van BRCA1 door RNAi resulteert in een sterke afname van de gedetecteerde GFP-positieve cellen.

De output van de FCA is een histogram met de GFP-intensiteit per cel op de x-as en het aantal cellen op de Y-as. In afwezigheid van transfectie met een expressieplasmid worden er geen GFP-positieve cellen gedetecteerd.

De resultaten in kolom twee tot en met zes zijn allemaal afkomstig van cellen waarin het ISC one-expressieplasmid op dag drie is getransfecteerd. In een typische set resultaten van een enkel experiment zijn 15,5% van de cellen GFP-positief na ISC one-expressie en controle-RNAi-depletie van een irrelevant gen; in vergelijking hiermee reduceerde depletie van BRCA one en add-back van een leeg plasmidvector de GFP-conversie tot 0,7%. Toevoeging van exogeen wildtype BRCA one herstelde de homologe recombinatie volledig, wat werd aangetoond door het verkrijgen van 15 tot 16% GFP-positieve cellen.

Op dezelfde wijze werd de expressie van een andere variant van onbekende betekenis onderzocht. De BRCA1 21B mutatie herstelde de BRCA1-afhankelijke homologe recombinatiefunctie volledig. De toevoeging van de BRCA1 M18T mutant had een vergelijkbaar effect als de vectorcontrole.

Aangezien deze variant op vergelijkbare niveaus werd tot expressie gebracht als het endogene eiwit, suggereert dit dat de BRCA1 M18T-variant niet functioneel is bij homologe recombinatie. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de celgroei te monitoren, aangezien de cellen langzaam groeien en een lage confluentie vertonen, waardoor de hoeveelheid gebruikte transfectiemengsel moet worden verminderd. Het is daarnaast belangrijk om het transfectiemedium tijdig te verwijderen.

We stellen vast dat er in de dagen na transfectie een hoge mate van cytotoxiciteit optreedt als er antibiotica in het medium zijn opgenomen. Om deze reden bevat al het medium na de eerste dag geen antibiotica. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van borstkankeronderzoek om de genetica van BRC1-varianten met onbekende klinische significantie in kankercentra te bestuderen.

We hopen dat de functionele BRC one-assay die in dit werk is ontwikkeld, zal zorgen voor een verbeterde voorspelling van de effecten van BRC one-varianten op de aanleg voor kanker.