Beoordeling van de virale replicatiecapaciteit met behulp van een radiogestempelde reverse-transcriptase-assay

Neem cultuursupernatanten die nakomelingen-virionen bevatten die zijn vrijgekomen uit gastcellen die zijn geïnfecteerd met ofwel een test-HIV-1-variant of een wild-type controle.

Het testvirus draagt een genvariant die de replicatie-efficiëntie verandert en de productie van nakomende virionen beïnvloedt.

Voeg de supernatanten toe aan een mengsel voor reverse transcriptie dat een radiogemarkeerd nucleotide, een niet-gemarkeerd nucleotide, een RNA-template, een primer, cofactoren, detergent en stabilisatoren bevat.

Incubeer om de vorming van het template-primercomplex mogelijk te maken, terwijl het detergent de virionen lyseert en zo het reverse transcriptase, of RT, vrijmaakt.

RT synthetiseert DNA vanuit het template-primercomplex, waarbij het radiogemarkeerde nucleotide wordt ingebouwd.

Breng de monsters over naar een membraan dat bindt aan nucleïnezuren en laat deze aan de lucht drogen om het radiogestempelde DNA te immobiliseren.

Was meerdere malen met buffer en ethanol onder agitatie om ongebonden componenten te verwijderen.

Laat het membraan aan de lucht drogen en wikkel het in. Stel het bloot aan een stralingsgevoelig scherm en detecteer de signalen met een phosphorimager.

Een vermind