Gecombineerde adenovirale transductie en siRNA-gemedieerde knockdown in kankercellen

Neem een cultuur van humane kankercellen die een endogeen doeleiwit tot expressie brengen en verwijder het medium.

Neem een suspensie van recombinant adenovirus dat een gen bevat dat codeert voor het targeteiwit met een fluorofoor-label.

Voeg een klein volume van de virale suspensie toe aan de cellen om nauw contact tussen het virus en het celoppervlak te waarborgen.

Incubeer met af en toe schudden om virale aanhechting mogelijk te maken.

Voeg extra medium toe aan de cultuur.

Voeg vervolgens een siRNA-calciumfosfaatcomplex toe om het mRNA van het endogene doeleiwit te targeten en incubeer dit.

Het calciumfosfaat verbetert de opname van siRNA, waarna het siRNA in het RISC wordt geladen.

Het siRNA–RISC-complex bindt vervolgens aan het doel-mRNA en splitst dit, waardoor de eiwitexpressie wordt geremd.

Tegelijkertijd dringt het adenovirus de cel binnen en laat het zijn DNA vrij, dat de expressie van het met een fluorofoor gelabelde doeleiwit aanstuurt.

Dit maakt de uitputting van het endogene doeleiwit en de gelijktijdige vervanging door het met een fluorofoor gelabelde eiwit mogelijk.

Was de cellen met buffer en voer fluorescentie-imaging uit om het doeleiwit te analyseren.

Label een microcentri