Zuiveren Plasmide DNA van bacteriële kolonies Met behulp van de Qiagen Miniprep Kit
29 juli 2007
Ik ben van het laboratorium van Mike Halen, Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine. Vandaag zal ik u laten zien hoe u een collagen mini-prep gebruikt om DNA uit bacteriën te zuiveren. Ik doe dit als een stap in een experiment voor site-directed mutagenese.
Nadat ik het plasmide heb verkregen, zal ik het insert sequensen om te verifiëren dat de geselecteerde klonen de gewenste mutaties bevatten. Voordat we de minipreparatie uitvoeren, introduceer ik kort wat we gisteren hebben gedaan. Om bacteriën te laten groeien, moet ik eerst vijf milliliter LB-medium in individuele buisjes inoculeren.
En zoals u kunt zien, is het medium helder voordat we de bacteriën in de buis plaatsen. Vervolgens gebruik ik een pipet om een enkele kolonie van een agarplaat te inoculeren, waarbij ik elke keer de tip vervang om contaminatie te voorkomen. Daarna plaats ik de buizen in een schudmachine en laat ik ze groeien bij 300 RPM gedurende ten minste acht uur; gewoonlijk kan dit gedurende de nacht gebeuren.
Er zijn drie belangrijke buffers uit de collagen mini preparation kit. Dit zijn P one, P two en N three. Normaal gesproken bewaren we P one bij 4 °C omdat het RNA's bevat; P two laten we op kamertemperatuur staan en N three bereiden we voor vlak voor het experiment, na acht uur.
Zoals u kunt zien, is het medium nu troebel omdat er bacteriën groeien; ik zal vijf microliter van het medium op een andere plaat uitplaten. Zodra ik de klonen heb geverifieerd, kan ik direct teruggaan naar de bacteriën en hoef ik geen nieuwe transformatie uit te voeren. Nadat we het medium hebben gecentrifugeerd, ziet u een mooi bacterieel pellet onderin de buis; we gieten het supernatant in bleekmiddel om milieuverontreiniging te voorkomen, terwijl het pellet behouden blijft.
Nu voeg ik buffer P1 toe aan de bacteriepellets. Buffer P1 is een resuspensiebuffer om de bacteriën te resuspenderen. Vervolgens pipetteer ik de oplossing op en neer om de bacteriën met de buffer te mengen.
In dit stadium mag er geen bacteriepalet in de oplossing zichtbaar zijn. Nu zal ik de geresuspendeerde bacteriën overbrengen naar een nieuwe appol-buis. Ik label mijn buisjes altijd, zodat ik ze kan onderscheiden en weet uit welke kloon welke oplossing afkomstig is.
Voeg nu buffer P2 toe aan elke buis; buffer P2 is een lysisbuffer om bacteriën te lyseren. Na het toevoegen van buffer P2 is te zien dat de oplossing nog niet helder is. Keer nu alle buisjes meerdere keren om, zodat de oplossing goed gemengd wordt.
U kunt nu zien dat de oplossing helder wordt. Nu voeg ik buffer N3 toe; buffer N3 is de neutralisatiebuffer voor elke buis. Zodra ik buffer N3 toevoeg, zie ik onmiddellijk de eiwitprecipitatie, maar ik zal ze nog enkele keren omkeren om de oplossing grondig te mengen.
Nadat we de oplossing grondig hebben gemengd. Zo zou het eruit moeten zien nadat ik buffer drie heb toegevoegd. Nu ga ik de sge gebruiken om het eiwitprecipitaat tijdens de centrifugatie gedurende 10 minuten naar beneden te centrifugeren; ik heb een Cal VAC six s geassembleerd.
Ik zet alle onderdelen in de juiste volgorde in elkaar en sluit ze vervolgens aan op een vacuümsysteem. Nu bevestig ik de hulpmiddelen voor de kalibratievoorbereiding, de riem aan het collectormanifold. Vandaag doen we er slechts één, dus ik blokkeer de overige gleuven.
We hebben nu een goed vacuüm. Zoals u kunt zien, heb ik de strip gelabeld volgens mijn buizen en zodra ik het vacuüm inschakel, is er een goed vacuüm. Oké, na het centrifugeren van de buis is het eiwitprecipitaat onderin zichtbaar en het DNA zou nog steeds opgelost moeten zijn in het supernatant.
Nu brengen we het supernatant, dat DNA bevat, over naar de cow prep-strips. Ik moet vermelden dat we altijd van tips moeten wisselen om kruiscontaminatie te voorkomen. Nu zet ik de vacuümpomp aan. Nu zet ik de vacuümpomp uit en voeg ik buffer PB toe om de strip te wassen, waarin het DNA zich momenteel in het filter bevindt.
Nu voeg ik de PB-oplossing toe aan de strip om deze te wassen; de strips bevatten nog steeds DNA in het filter. Deze keer hoef ik de tips niet te wisselen, mits ik de strip niet aanraak. Nu voeg ik buffer P toe aan de strip op dezelfde manier als ik dat deed voor buffer PB.
En dit doe ik twee keer nadat ik het vacuüm heb ingeschakeld. Zoals u kunt zien, stroomt de P-oplossing momenteel door de strip en we laten het vacuüm nog vijf minuten aanstaan om er zeker van te zijn dat het filter goed droog is. Haal na vijf minuten vacuüm de strip uit de doos en wikkel deze vervolgens in Kimwipes. Tik de strip tegen de tafel om het resterende P-buffer te verwijderen.
En nu kunt u zien dat er nog maar een paar druppels P-buffer over zijn en dat het DNA nog in het filter moet zitten. Hier zijn de opvangmicrobuisjes. Ik heb ze gelabeld volgens de strip.
Nu open ik de car vac en zet ik deze weer in elkaar met de collectie-microbuisjes en zorg ik dat de strip overeenkomt met de microbuisjes. Zo zou het manifold er nu uit moeten zien. Hier is een overzicht van het vac-manifold, dat is voorbereid om DNA van de strip naar het microbuisje te elueren.
De strip bevindt zich bovenop en de buis bevindt zich er direct onder, op dezelfde wijze gelabeld. Voeg nu steriel water toe aan de strip zonder vacuüm en laat dit een minuut staan. Wanneer het vacuüm nu lang aanhoudt, is te zien dat het water door de strip stroomt en in de opvangmicrobuisjes terechtkomt.
Het water bevat het DNA. Ik laat het vacuüm ook nog een tijdje aanstaan om er zeker van te zijn dat al het water wordt opgevangen. Hier zijn de opvangmicrobuisjes met de DNA-oplossing na deze stap.
Hallo, ik heb zojuist gedemonstreerd hoe u een calcium miniprep-kit gebruikt om DNA uit bacteriën te zuiveren. Nu we het insert hebben gesequenced om de juiste klonen te verifiëren, moet ik vermelden dat deze methode is gebruikt. De hoeveelheid DNA ligt gewoonlijk rond het microgramniveau.
En veel succes met uw experimenten. Bedankt voor het kijken.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze video demonstreert het gebruik van collagen mini fabrication voor het zuiveren van DNA uit bacteriën als onderdeel van een experiment voor site-directed mutagenese. Het proces omvat het inoculeren van bacteriën en het voorbereiden van plasmiden voor sequencing om mutaties te verifiëren.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Biofysica
- Genetica
- Moleculaire biologie
Achtergrond
- Het begrijpen van DNA-zuiveringstechnieken is essentieel voor genetische manipulatie.
- Site-directed mutagenese maakt nauwkeurige wijzigingen in DNA-sequenties mogelijk.
- Verificatie van mutaties is cruciaal voor het bevestigen van experimentele resultaten.
- Het inoculeren van bacteriën is de eerste stap bij de voorbereiding op DNA-extractie.
Doel van de studie
- Om een methode aan te tonen voor het zuiveren van DNA uit bacteriële culturen.
- Om de stappen te illustreren die betrokken zijn bij site-directed mutagenese.
- Om het belang van sequencing te benadrukken bij het bevestigen van genetische modificaties.
Gebruikte methoden
- Fabricage van collageen-mini voor DNA-zuivering.
- Inoculatie van bacteriële culturen in LB-medium.
- Voorbereiding van plasmiden voor sequencing.
- Verificatie van geselecteerde klonen op de gewenste mutaties.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle zuivering van DNA uit bacteriële monsters.
- Voorbereiding van plasmiden die klaar zijn voor sequencing.
- Bevestiging van mutaties via sequencingresultaten.
- Demonstratie van effectieve inoculatietechnieken.
Conclusies
- De methode voor collagen mini-fabricage is effectief voor DNA-zuivering.
- Site-directed mutagenese is een betrouwbare techniek voor genetische studies.
- Sequencing is essentieel voor het valideren van genetische modificaties.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Leidinggevenden
Plasmid-DNA-zuivering is een fundamentele stap in workflows voor moleculaire klonering, waarmee snelle verificatie van klonen en downstream-applicaties zoals PCR en restrictie-enzymdigestie mogelijk worden gemaakt. De QIAprep 8 Miniprep Kit biedt een fenol- en chloroformvrije methode die plasmid-DNA van hoge zuiverheid levert in minder dan twee uur, ter ondersteuning van vroege ontdekkingsfasen. Deze techniek vermindert het biologische risico door een betrouwbare DNA-isolatie te waarborgen voor mutagenese, sequencing en functionele validatie in pipelines voor targetidentificatie.
Strategische Toepassingen in Biofarma R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door middel van betrouwbare plasmidisolatie voor mutagenese en sequencing.
- Operationele waarde: Ondersteunt snelle screening van klonen zonder gevaarlijke reagentia, waardoor de laboratoriumveiligheid en doorvoersnelheid worden verbeterd.
- Voorspellende waarde: Levert DNA van voldoende kwaliteit en opbrengst (~microgramniveau) voor een nauwkeurige verificatie van mutaties.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Levert gezuiverd plasmid DNA dat geschikt is voor enzymatische reacties zoals PCR en restrictiedigestie.
- Operationele waarde: Elimineert de noodzaak van fenol, chloroform, CsCl, ethidiumbromide en alcoholprecipitatie, waardoor de workflow wordt vereenvoudigd.
- Klaar voor assay: Produceert een consistente DNA-opbrengst, wat gestandaardiseerde downstream analytische procedures mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Translationele continuïteit: Gezuiverde plasmiden ondersteunen de voortgang van kloonverificatie naar preklinische functionele studies.
- Mechanistische risicoreductie: Bevestigt genetische modificaties via sequencing, waardoor ambiguïteit bij targetvalidatie wordt verminderd.
- Voorbereidend nut: Genereert DNA-templates voor expressieconstructen die worden gebruikt in ziekte-relevante systemen.
Integratie van pipeline en workflow
Het miniprep-proces past binnen het vroege stadium van de ontdekkingscontinuüm en vormt de schakel tussen de voorbereiding van bacteriële culturen en plasmid-afhankelijke toepassingen zoals mutagenese en sequencing.
- Discovery Biology: Faciliteert het testen van hypothesen door DNA te leveren voor site-directed mutagenese en sequentiebevestiging.
- Screening: Maakt high-fidelity plasmidterugwinning mogelijk voor enzymatische validatie en kloonselectie.
- Analytics: Levert DNA op dat geschikt is voor kwantificering, sequenering en enzymatische analyse om de integriteit van klonen te beoordelen.
- Translationeel onderzoek: Ondersteunt de generatie van gevalideerde plasmiden voor gebruik in expressiesystemen en fenotypische assays.
- Enterprise Reuse: Vertegenwoordigt een gestandaardiseerde, schaalbare methode die toepasbaar is over meerdere kloneringsprojecten en teams.
Operationele en organisatorische impact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen bij de selectie van klonen door middel van betrouwbare, contaminatievrije DNA-purificatie.
- Operationele waarde: Standardiseert de plasmidepreparatie tussen gebruikers, waardoor variabiliteit en het risico op kruiscontaminatie worden verminderd.
- Strategische waarde: Versnelt go/no-go-beslissingen in kloningsworkflows door snelle verificatie van mutaties mogelijk te maken.
- Impact op portfolio: Verbetert de efficiëntie bij de identificatie van lead-verbindingen door het aantal mislukte klonen als gevolg van artefacten bij de plasmidepreparatie te minimaliseren.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist een basisopleiding in moleculaire biologie op het gebied van aseptische techniek en plasmidhandtering.
- Afhankelijk van toegang tot een microcentrifuge, vacuümsysteem en QIAprep spin-kolommen of strips.
- Vereist gestandaardiseerde labelings- en tip-vervangingsprocedures om kruiscontaminatie te voorkomen.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten volumeschaal en compatibiliteit met verschillende bacteriële stammen.
- Praktische beperking: Ontworpen voor prep op kleine schaal (<5 mL cultuur); niet geschikt voor grootschalige plasmidproductie.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
8:48
Conclusion
5:15
Binding Plasmid DNA to Qiastrip and Washing with Buffers PB and PE
1:24
Resuspending and Lysing Bacteria with Buffers P1 and P2
3:56
Precipitating Bacterial Protein with Buffer N3
0:07
Introduction
7:19
Eluting DNA in Collection Tubes
4:38
Assembling the Qiavac Manifold during Centrifugation
0:46
Growing Up Bacteria
