Name: Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Leer membraaneiwitkristallisatie in lipide kubische fase voor structurele biologie. Deze methode optimaliseert kristalopbrengst via LCP-FRAP screening en reconstitutie voor röntgendiffractie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gefinancierd in delen door de NIH beurzen GM073197 en RR025336.

Een typische schets van een in meso kristallisatie experiment is te zien in Fig.1 1,2. Pre-kristallisatie LCP-FRAP assays zijn optioneel, maar zij aanzienlijk kunnen versnellen het proces van het zoeken voor een eerste kristallisatie omstandigheden, vooral in het geval van moeilijke membraaneiwitten 3. 1. Eiwit reconstitutie in LCP <ol><li> Zuiver een membraan eiwit van interesse in een reinigingsmiddel en concentreren de eiwit / reinigingsmiddel complexen tot ~ 10 - 20 mg / ml, zorg ervoor dat u over-concentratie het wasmiddel 1,4. </li><li> Transfer ~ 25 mg van een LCP gastheer lipiden (meestal monoolein) of een lipide mengsel in een 1,5 ml plastic buisje en incubeer bij 40 ° C gedurende enkele minuten totdat de lipide smelt. </li><li> Bevestig een injectiespuit koppeling naar een 100 ul gasdichte injectiespuit. </li><li> Plaats de spuit met de gesmolten lipide met een regelbaar volume pipet. Noteer het volume van de lipiden in de spuit. </li><li> Plaats een ander 100 pi spuit met het eiwit-oplossing in een eiwitoplossing-to-lipide-verhouding 2 / 3 v / v. </li><li> Met elkaar te verbinden beide spuiten door de spuit koppeling. </li><li> Duw de spuit plunjers afwisselend naar de lipide en eiwit bewegen door de binnenste naald van de koppeling, heen en weer, totdat de lipide mesofase wordt homogeen. LCP vormen spontaan op mechanisch mengen, en het eiwit wordt opgelost in de lipide dubbellaag van LCP. Vorming van LCP kan worden gecontroleerd door de transparante en gel-achtige consistentie en door de afwezigheid van birefringency wanneer bekeken onder een microscoop uitgerust met cross-polarisatoren, of, indien mogelijk, door gebruik te kleine hoek X-stralen diffractie 1. </li></ol> 2. LCP-FRAP Pre-kristallisatie Assays LCP-FRAP assays zijn ontworpen om de diffusie-eigenschappen van membraaneiwitten opgelost in LCP op een verscheidenheid van screening voorwaarden 3 te meten. De lange-afstands diffusie van membraaneiwitten in LCP is essentieel voor een succesvolle kristallisatie, maar de microstructuur van LCP beperkingen verspreiding van grote eiwitten of oligomere eiwit aggregaten. Een veel voorkomende reden voor het falen van een in meso kristallisatie experiment is een snelle aggregatie van eiwitten leidt tot een verlies van diffusie. Het is aangetoond dat de samenvoeging gedrag van een eiwit is afhankelijk van het specifieke eiwit construct, de gastheer lipiden en de samenstelling van de screening oplossing 3. <ol><li> Etiket het eiwit met een fluorescerende kleurstof (Cy3 of gelijkwaardig) op een eiwit / kleurstof verhouding van ~ 100 / 1, verwijder de kleurstof niet gereageerd en concentreer het eiwit tot ~ 1 mg / ml. Label ofwel vrij aminen of gratis thiolen. Bij de etikettering gratis amines, gebruik pH tussen 7 en 7,5 tot voornamelijk het label van de vrije N-terminus. Wees u ervan bewust dat de amino-etikettering ook lipiden co-gezuiverd met het eiwit 2,3 label. </li><li> Reconstitueer de gelabelde eiwit in LCP zoals beschreven in paragraaf 1). </li><li> Stel assay platen, zoals beschreven in hoofdstuk 3) met behulp van LCP-FRAP screening oplossingen in plaats van kristallisatie schermen 2. </li><li> Incubeer de platen bij 20 ° C in het donker voor ten minste 12 uur aan een evenwichtstoestand te bereiken. </li><li> Plaats een van de platen op de LCP-FRAP station en richten zich op de eerste put met behulp van een 10x doelstelling. </li><li> Acquire 5 fluorescerende beelden naar de eerste pre-gebleekt toestand vast te leggen. </li><li> Trigger de laser. Het laservermogen en het aantal pulsen moet worden aangepast voor het bleken van ~ 30 - 70% van de gelabelde eiwitten in het midden van de gebleekte plek. </li><li> Onmiddellijk na het activeren van de laser, start het opnemen van een snelle post-bleken opeenvolging van ~ 200 beelden op de snelst mogelijke tarief. </li><li> Volgen met het opnemen van een langzame post-bleekmiddelen opeenvolging van ~ 50 beelden, het selecteren van de vertraging tussen de beelden als 10-20 s, afhankelijk van de diffusiesnelheid van het eiwit. </li><li> Integreer de intensiteit in het bleekmiddel plek in alle frames en corrigeren voor het bleken en de lichtsterkte fluctuaties bij de overname van delen van de intensiteit in de gebleekte ter plaatse door de gemiddelde intensiteit van een referentiestip buiten de laser gebleekte gebied. </li><li> Normaliseren van de gecorrigeerde intensiteit naar de pre-gebleekt intensiteit die gelijk is aan 1 en de eerste gebleekt intensiteit gelijk aan 0 te maken. </li><li> Passen bij de curve van de genormaliseerde intensiteit versus tijd, F (t), met behulp van de volgende vergelijking 5: F (t) = M x exp (-2T / t) x (I 0 (2T / t) + I 1 (2T / t)), (Eq.1) waarbij M is de mobiele fractie van diffusie moleculen, T is de karakteristieke diffusie tijd, t is de echte tijd van elke geregistreerde frame, I 0 en I 1 zijn de 0 e en 1 e orde gewijzigde Bessel-functies. </li><li> Bereken de diffusie coëfficiënt, D, als: D = R 2 / 4T, (Eq.2) waarin R de straal van de gebleekte plek. </li><li> Verplaats to het volgende goed en herhaal de stappen 2.5) - 2,13). </li><li> Vergelijk de mobiele fracties en diffusie coëfficiënten verkregen voor de verschillende screening voorwaarden. Ontwerp nieuwe kristallisatie-schermen op basis van de componenten die gefaciliteerd eiwit diffusie en exclusief de voorwaarden voor welk eiwit diffusie niet werd waargenomen. Als het eiwit niet diffuus in een van de gescreende voorwaarden, overwegen om de screening ruimte of te proberen een nieuw eiwit te bouwen. </li></ol> 3. Het opzetten van LCP Kristallisatie Trials <ol><li> Reconstrueren het eiwit in LCP zoals beschreven in paragraaf 1). </li><li> Breng de eiwit-beladen LCP in een 10 ul gasdichte injectiespuit bevestigd aan een zich herhalend spuit dispenser. </li><li> Bevestig een korte verwisselbare naald (gauge 26, 10 mm lengte) aan de 10 pi spuit. </li><li> Verdeel 200 nL bolussen van LCP op het oppervlak van de vier aangrenzende putten de vorming van een 2x2 vierkant. </li><li> Overlay elk van de LCP bolussen met 1 pl van overeenkomstige kristallisatie scherm oplossing. </li><li> Cap vier vol putten met een 18 mm vierkante glazen dekglaasje aan. Breng een zachte druk op het dekglaasje om de putten afdichting. </li><li> Herhaal stap 3.4) -3.6) met de volgende reeks van vier putten tot de hele plaat is gevuld. </li><li> Incubeer de plaat op een constante temperatuur, regelmatig te controleren op kristal vorming en groei. </li></ol> 4. Oogsten Kristallen van LCP <ol><li> Plaats een bord met eiwitkristallen onder een stereomicroscoop met variabele zoom, uitgerust met een roterende lineaire polarisator en analysator. </li><li> Focus op de bron van belang het gebruik van een low power zoom, zodat het geheel goed wordt geplaatst binnen het gezichtsveld. </li><li> Scoren het dekglaasje glas in vier slagen het maken van een vierkant binnen de grenzen goed met behulp van een scherpe hoek van een keramische capillaire snijden steen. </li><li> Druk op rond de omtrek scoorde met sterke scherpe punt pincet om de krassen voortplanten door de dikte van het dekglaasje glas. </li><li> Punch twee kleine gaatjes aan de tegenovergestelde hoeken van het plein gescoord. </li><li> Injecteer enkele pi van neerslagmiddelen oplossing door een van de gaten om uitdroging te verminderen tijdens de daaropvolgende stappen. </li><li> Met behulp van een haakse scherpe naald sonde breken het glas langs een of twee kanten aan de cut-out plein vrij. </li><li> Til het glas plein kijken voor de kubieke fase bolus. Als de bolus is vast aan het dekglaasje, draai het glas plein over en op de bodem van de put. </li><li> Voeg een extra paar pi van neerslagmiddelen oplossing, aangevuld met een cryo-protectant, indien nodig, op de top van de blootgestelde kubieke fase bolus in de put. </li><li> De vergroting van de microscoop en de focus op een kristal. </li><li> Pas de hoek tussen de polarisator en de analysator om het contrast tussen de dubbelbrekend kristal en op de achtergrond te verhogen, met behoud van genoeg licht om de oogst loop te zien. </li><li> Selecteer een MiTeGen MicroMount met een diameter overeenkomt met de kristal grootte en dan direct de oogst van het kristal uit de LCP door scheppen het in de MicroMount. </li><li> Flash bevriezen MicroMount met de geoogste kristal in vloeibare stikstof, en het schip naar een synchrotron bron bundellijn voor X-ray het verzamelen van gegevens 6. </li></ol> 5. Representatieve resultaten: Een aangelegde menselijke bèta-2-adrenerge G-eiwit gekoppelde receptor (β 2 AR-T4L) werd uitgedrukt in baculovirus geïnfecteerde Sf9 insectencellen en gezuiverd in dodecylmaltoside (DDM) / cholesteryl hemisuccinaat (CHS) detergent oplossing gebonden aan een partiële agonist inverse carazolol 7. Het eiwit werd gelabeld met Cy3 NHS ester en wordt gebruikt in LCP-FRAP pre-kristallisatie assays (figuur 2). Grof grid-schermen op basis van een aantal voorwaarden geselecteerd uit de resultaten van de LCP-FRAP assays produceerde de eerste kristal-achtige hits (figuur 3). Verdere optimalisatie van neerslagmiddelen voorwaarden leverde diffractie kwaliteit kristallen (figuur 4). <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Flow-chart van een typisch LCP kristallisatie experiment. Stappen in de grijze velden zijn niet beschreven in de huidige protocollen. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. LCP-FRAP test met β 2 AR-T4L/carazolol in monoolein op basis van LCP. A) De resultaten van een LCP-FRAP test uitgevoerd in een automatische high-throughput-modus, waarbij elk monster van een 96-wells plaat sequentieel is gebleekt en fluorescentie herstel is gemeten na een 30 minuten incubatie. De verkregen fluorescentie terugvorderingen, die de mobiele fractie in elk monster vertegenwoordigen, worden uitgezet voor alle 96 monsters. De screening oplossingen bevatten 0,1 M Tris pH 8, 30% v / v PEG 400 in combinatie met 48 verschillende zouten op twee verschillende concentraties. B) Fluorescentie herstel profielen voor verschillende reprepresentatieve omstandigheden. Vaste lijn curves past door Eq. 1.Het mobiele fracties en de diffusie coëfficiënten worden bepaald met behulp van MKN. 1 en 2. Snel herstel van minder dan 10% in het monster met Na-chloride is het gevolg van fluorescent gelabelde lipiden co-gezuiverd met het eiwit. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Initiële kristal hits van β 2 AR-T4L/carazolol verkregen door een grof raster screening rond de meest veelbelovende voorwaarden die door de LCP-FRAP, met daarin Na sulfaat (paneel A) en Na Formate (paneel B). Het eiwit is gelabeld met Cy3 NHS ester en de fluorescerende beelden worden gemaakt met excitatie bij 543 nm en emissie bij 605 nm. <img src="/files/ftp_upload/2501/2501fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Geoptimaliseerd kristallen van β 2 AR-T4L/carazolol. De beelden van kristallen gekweekt in de aanwezigheid van Na sulfaat (panelen A en B) en K Formate (panelen C en D) worden genomen in de helderveld-modus (panelen A en C) en het gebruik van cross-polarisatoren (panelen B en D).

<ol><li>Caffrey, M., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallizing+membrane+proteins+using+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases.</a> Nat. Protoc. 4, 706-731 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs%2C+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-170 (2010).</li>
<li>Cherezov, V., Liu, J., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LCP-FRAP+assay+for+pre-screening+membrane+proteins+for+in+meso+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cryst.+Growth+Design%22%5BJournal%5D)">LCP-FRAP assay for pre-screening membrane proteins for in meso crystallization.</a> J. Cryst. Growth Design. 8, 4307-4315 (2008).</li>
<li>Misquitta, Y., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergents+destabilize+the+cubic+phase+of+monoolein%3A+implications+for+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detergents destabilize the cubic phase of monoolein: implications for membrane protein crystallization.</a> Biophys. J. 79, 394-405 (2003).</li>
<li>Soumpasis, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+analysis+of+fluorescence+photobleaching+recovery+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments.</a> Biophys. J. 41, 95-97 (1983).</li>
<li>Cherezov, V., Hanson, M. A., Griffith, M. T., Hilgart, M. C., Sanishvili, R., Nagarajan, V., Stepanov, S., Fischetti, R. F., Kuhn, P., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rastering+strategy+for+screening+and+centering+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+micrometer+size+X-ray+synchrotron+beam%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Soc.+Interface%22%5BJournal%5D)">Rastering strategy for screening and centering of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 micrometer size X-ray synchrotron beam.</a> J. R. Soc. Interface. 6, S587-S597 (2009).</li>
<li>Cherezov, V., Rosenbaum, D. M., Hanson, M. A., Rasmussen, S. G., Thian, F. S., Kobilka, T. S., Choi, H. J., Kuhn, P., Weis, W. I., Kobilka, B. K., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+an+engineered+human+beta2-adrenergic+G+protein-coupled+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor.</a> Science. 318, 1258-1265 (2007).</li>
<li>Cherezov, V., Peddi, A., Muthusubramaniam, L., Zheng, Y. F., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robotic+system+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr.+D%22%5BJournal%5D)">A robotic system for crystallizing membrane and soluble proteins in lipidic mesophases.</a> Acta Crystallogr. D. 60, 1795-1807 (2004).</li>
<li>Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+optical+imaging+of+integral+membrane+protein+crystals+in+lipidic+mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases.</a> Anal. Chem. 82, 491-497 (2010).</li>
<li>Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+mechanical+mixer+for+small+viscous+lipid-containing+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Phys.+Lipids%22%5BJournal%5D)">A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples.</a> Chem. Phys. Lipids. 95, 11-21 (1998).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+nanoliter-volume+dispenser+for+highly+viscous+materials+used+in+membrane+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive nanoliter-volume dispenser for highly viscous materials used in membrane protein crystallization.</a> J. Appl. Cryst. 38, 398-400 (2005).</li>
<li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast%2C+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li>
<li>Cherezov, V., Fersi, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+screens%3A+compatibility+with+the+lipidic+cubic+phase+for+in+meso+crystallization+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Crystallization screens: compatibility with the lipidic cubic phase for in meso crystallization of membrane proteins.</a> Biophys J. 81, 225-242 (2001).</li>
</ol>

De protocollen bieden een basis visuele leidraad voor de belangrijkste stappen die betrokken zijn bij het ​​uitvoeren van in meso kristallisatie experimenten. Meer diepgaande details met betrekking tot deze protocollen, met de nadruk mogelijke valkuilen, tekortkomingen of alternatieve routes zijn elders beschikbaar 1,2. Optionele LCP-FRAP testen kunnen helpen bij de eerdere stadia van de meest veelbelovende eiwitten te bouwen, LCP gastheer lipiden en lipide additieven, evenals beperking van de range van mogelijke neerslagmiddelen en buffer voorwaarden 3 te selecteren. Zodra een eerste kristallisatie hit wordt gevonden, moet worden geoptimaliseerd om een ​​betere kwaliteit kristallen te verkrijgen. Optimalisatie van in meso kristallisatie omstandigheden wezen gelijkwaardig is aan het optimaliseren van de voorwaarden voor oplosbare eiwitten met de toevoeging van extra parameters in verband met de samenstelling van een LCP. Membraaneiwit kristallen gegroeid lipidische mesofase zijn meestal kleiner dan kristallen verkregen in detergent oplossing, maar meer besteld, dus profiteert sterk van het gebruik van microfocus bundellijnen verkrijgbaar bij de moderne synchrotron bronnen 6. Veel van de procedures met betrekking tot in meso kristallisatie, inclusief het opzetten van kristallisatie of assay platen, het uitvoeren van LCP-FRAP assays en het opsporen van kristallen, zijn semi-of volautomatische 1,2,8,9, waardoor het screenen van een groot aantal voorwaarden terwijl het verbruiken kleine hoeveelheden eiwitten en lipiden. Aan de andere kant, eiwit reconstructies in LCP en kristal oogsten blijven handleiding en meer vervelende operaties en, dus, hebben een behoefte aan verbetering.

<table><tbody><tr><td>100 &amp;mu;L gasdichte spuit</td><td>Hamilton Co</td><td>7656-01</td><td>Er zijn 2 spuiten vereist</td></tr><tr><td>10 &amp;mu;L gasdichte spuit</td><td>Hamilton Co</td><td>7653-01</td><td></td></tr><tr><td>Spuitkoppeling</td><td>Hamilton Co</td><td>7770-02 30902</td><td>De koppeling kan worden gemaakt met beschikbare onderdelen zoals beschreven in ref. 10</td></tr><tr><td>Repetitieve spuitdispenser</td><td>Hamilton Co</td><td>83700</td><td>De repetitieve spuitdispenser kan worden aangepast om het doseervolume met ~3 keer te verlagen&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Korte (0,375&amp;#8221;) afneembare naald met platte punt (puntstijl 3, gauge 26)</td><td>Hamilton Co</td><td>7804-03</td><td></td></tr><tr><td>96-well glazen sandwichplaat</td><td>Marienfeld</td><td>08 900 03</td><td>Voor handmatige handelingen is het praktischer om de glazen sandwichplaat samen te stellen met standaard microscoopglasplaatjes en dubbelzijdige plakband met geperforeerde gaten&lt;sup&gt;1,2,12&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Glazen dekglas</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63787-01</td><td></td></tr><tr><td>monooleine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7765</td><td></td></tr><tr><td>Kristallisatieschermen</td><td>Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience</td><td></td><td>De meeste beschikbare commerciële schermen kunnen worden gebruikt voor de initiële screening. Condities die LCP consistent verstoren, kunnen 2x worden verdund voor een betere compatibiliteit&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Capillaire snijsteen</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-334</td><td></td></tr><tr><td>Fijnpuntige pincet</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>510</td><td></td></tr><tr><td>Gehoekte scherpe probe</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>13650</td><td></td></tr><tr><td>MicroMounts</td><td>MiTeGen</td><td>M1-Lxx-xx</td><td>Selecteer de MicroMount-diameter die overeenkomt met de kristalgrootte</td></tr></tbody></table>

kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membraaneiwitten uitvoeren kritische functies in levende cellen met betrekking tot transductie, vervoer en energie transformaties, en als zodanig betrokken zijn in een veelheid van storingen en ziekten signaal. Er is echter een structurele en functionele kennis van membraaneiwitten sterk achter bij die van hun oplosbare partners, vooral, te wijten aan problemen in verband met hun oplosbaar en het genereren van diffractie kwaliteit kristallen. Kristallisatie in lipidische mesofasen (ook bekend als in meso-of LCP kristallisatie) is een veelbelovende techniek die met succes werd toegepast op een hoge resolutie structuren van microbiële rhodopsins, fotosynthese-eiwitten, buitenste membraan beta vaten en G-eiwit gekoppelde receptoren te verkrijgen. In meso kristallisatie maakt gebruik van een native-achtige membraan omgeving en meestal produceert kristallen met een lager gehalte aan oplosmiddelen en een betere bestellen in vergelijking met traditionele kristallisatie uit detergent oplossingen. De methode is niet moeilijk, maar vereist een begrip van de lipide-fasegedrag en de praktijk in het omgaan met viskeuze mesofase materialen. Hier laten we zien een eenvoudige en efficiënte manier van het maken van LCP en de reconstructie van een membraan eiwit in de lipide dubbellaag van het LCP met behulp van een injectiespuit mixer, gevolgd door doseren nanoliter gedeelten van LCP in een assay of kristallisatie plaat, het uitvoeren van pre-kristallisatie assays en het oogsten van de kristallen de LCP matrix. Deze protocollen bieden een basis handleiding voor het naderen in meso kristallisatie onderzoeken, maar net als bij elke kristallisatie experiment, uitgebreide screening en optimalisatie nodig zijn, en een succesvolle uitkomst is niet per definitie gegarandeerd.

De protocollen beschrijven de essentiële stappen voor het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen van een membraaneiwit vanaf reconstructie van het eiwit in een lipidische kubieke fase (LCP), het vinden van de eerste voorwaarden met LCP-FRAP pre-kristallisatie assays, het opzetten van LCP kristallisatie onderzoeken en oogsten kristallen .

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Membraaneiwitten vervullen cruciale functies in levende cellen met betrekking tot signaaltransductie, transport en energietransformaties, en zijn daarom ...

Het algemene doel van de volgende procedure is het verkrijgen van kwaliteitskristallen van een membraaneiwit voor structuurbepaling via röntgenkristallografie. Dit wordt bereikt door eiwitreconstitutie in het membraan van een lipide kubische fase en incubatie met een precipitatie-oplossing, die kristalnucleatie en -groei induceert dankzij een grote crystallisatieruimte en beperkte feedback uit crystallisatie-experimenten. De lipide kubische fase fluorescence recovery after PHOTOBLEACHING of LCP Frap Prec crystallisatie-assay is ontwikkeld om de meest veelbelovende crystallisatiecondities te selecteren.Deze assay vermindert de hoeveelheid screening en vergroot de kans op het verkrijgen van initiële kristallisatiehits. Zodra de eerste hits zijn gevonden, worden optimalisatieproeven opgezet om de kristalgroei te verbeteren. Ten slotte worden de geoptimaliseerde kristallen geoogst en bevroren in vloeibare stikstof voor gegevensverzameling bij een synchrotronbron.De resultaten tonen het effectieve gebruik van de LCP FRA-assay voor het verkrijgen van initiële kristallen van de β2-adrenerge receptor in LCP, waarvan verdere optimalisatie leidde tot kristallen met diffractiekwaliteit. Deze techniek maakt gebruik van een membraanomgeving die vergelijkbaar is met de natuurlijke situatie, geboden door de herhaalde kubische fase, en resulteert doorgaans in kristallen met een laag oplosmiddelgehalte en een betere ordening in vergelijking met kristallisatie in detergentoplossingen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn aan deze methode moeite hebben vanwege de hoge viscositeit en de thixotrope eigenschappen van lipide mesofasen, waardoor deze materialen moeilijk te hanteren zijn.Wanneer de juiste instrumenten worden gebruikt en de techniek wordt beheerst, is deze procedure echter niet moeilijker dan elke andere proteïnekristallisatietechniek en is deze geschikt voor automatisering en high-throughput. Laten we beginnen. Purificeer het membraaneiwit van belang in een detergentoplossing en concentreer de eiwit-detergentcomplexen tot ongeveer 10 tot 20 mg/mL.Breng ongeveer 25 milligram A LCP gastlipid of een lipidemengsel over in een plastic buisje en incubeer dit enkele minuten bij 40 °C tot het lipide is gesmolten. Bevestig vervolgens een spuitkoppeling aan een gastdichte spuit van 100 µL. Vul de spuit met het gesmolten lipide met behulp van een regelbare pipette.Noteer het volume van het lipide in de spuit. Vul een andere spuit van 100 µL met voldoende eiwitoplossing om een verhouding tussen de eiwitoplossing en het lipide van twee tot drie volume per volume te verkrijgen. Verbind beide spuiten via de spuitkoppelaar. Duw de spuitplunjers afwisselend in om het lipide en het eiwit heen en weer door de binnennaald van de koppelaar te bewegen totdat de mesofase van het lipide homogeen wordt.LCP vormt zich spontaan bij mechanisch mengen en het eiwit wordt gereconstitueerd in de lipide dubbellaag van de LCP. De vorming van LCP kan worden geverifieerd aan de transparante en gelachtige consistentie, en aan de afwezigheid van dubbelbreking wanneer bekeken onder een microscoop die is uitgerust met kruispolarisatoren, of indien mogelijk door middel van klein-hoekige röntgendiffractie. Om te beginnen met LCP-FRAP-assays, label het eiwit met een fluorescente kleurstof bij een eiwit-tot-kleurstofverhouding van ongeveer 100 op één, zoals beschreven in het schriftelijke protocol.Verwijder de niet-gereageerde kleurstof en concentreer het eiwit tot ongeveer één milligram per milliliter. Reconstitueer vervolgens het gelabelde eiwit in LCP op dezelfde wijze als gedaan is voor het niet-gelabelde eiwit. Stel de assayplaten op.Gebruik LCP-wrap-screeningsoplossingen. Draag eerst het eiwitgeladen LCP over naar een gasdichte spuit van 10 µL die is bevestigd aan een repetitieve spuitdispenser, en bevestig vervolgens een korte, afneembare naald aan de spuit van 10 µL. Doseer bolussen van 200 nL LCP op het oppervlak van vier aangrenzende wells, waarbij een vierkant van twee bij twee wordt gevormd; bedek elke LCP-bolus met 1 µL van de overeenkomstige LCP FRA-screeningsoplossing.Zodra de screeningsoplossing is gedoseerd, worden de vier gevulde wells afgesloten met een vierkant glazen dekglas van 18 millimeter. Oefen een lichte druk uit op het dekglas om de wells te verzegelen. Herhaal dit proces voor de volgende set van vier wells totdat de gehele plaat is gevuld.Zodra de platen zijn gevuld, worden ze afgedekt met folie. Incubeer de platen bij 20 °C gedurende ten minste 12 uur. Om een evenwichtstoestand te bereiken, wordt een van de platen op het LCP Frap-station geplaatst en wordt er met een 10× objectief op de eerste well gefocust.De FRAP-data-acquisitie wordt automatisch uitgevoerd met een Image Pro-script, waarbij de gebruiker eerst alle acquisitieparameters invoert en vervolgens op de startknop drukt. Een typische acquisitiesequentie begint met het vastleggen van vijf pre-bleach beelden, waarna de bleachinglaser wordt geactiveerd, gesynchroniseerd met het streamen van een snelle herstelsequentie van ongeveer 200 beelden tegen de hoogst mogelijke snelheid. Dit wordt gevolgd door een langzame herstelsequentie van 50 beelden met intervallen van één tot 20 seconden tussen de beelden, afhankelijk van de diffusiesnelheid van het eiwit. Nadat de gegevensverzameling is voltooid, wordt de intensiteit binnen de bleach-spot en voor referentiepunten buiten het door de laser gebleekte gebied in alle frames geïntegreerd en gecorrigeerd.De geïntegreerde intensiteitscurve voor afwijkingen veroorzaakt door lichtfluctuaties en bleken tijdens de data-acquisitie normaliseert de gecorrigeerde intensiteit, zodat de intensiteit vóór het bleken gelijk is aan één en de initiële gebleekte intensiteit gelijk is aan nul; fit de curve van de genormaliseerde intensiteit tegenover de tijd zoals beschreven in het schriftelijke protocol om de mobiele fractie en de diffusiecoëfficiënt te bepalen. Herhaal deze procedure voor de volgende monsters en vergelijk de mobiele fracties en diffusiecoëfficiënten die zijn verkregen voor de verschillende screeningscondities. Ontwerp nu crystallisatie-screens op basis van de componenten die de eiwitdiffusie faciliteerden en sluit condities uit waarbij geen eiwitdiffusie werd waargenomen, om LCP-crystallisatieproeven op te zetten.Reconstitueer het eiwit in LCP zoals eerder beschreven en stel vervolgens kristallisatieplaten op zoals bij LCP frap, maar dan met kristallisatie-screeningsoplossingen. Alternatief kunnen kristallisatieproeven robotisch worden opgezet nadat de kristallisatieplaten zijn voorbereid; incubeer deze op een constante temperatuur en controleer periodiek op kristalvorming en -groei. Zodra de eiwitkristallen zijn gegroeid, plaatst u een plaat met de kristallen onder een stereomicroscoop met variabele zoom, uitgerust met een lineaire roterende polarisator en analyzer.Focus op de betreffende put met een lage zoomvergroting, zodat de gehele put zich binnen het gezichtsveld bevindt. Kras het dekglas in vier bewegingen aan, waarbij een vierkant binnen de grenzen van de put wordt gevormd met een scherpe hoek van een keramische capillaire snijsteen. Druk rondom de bekraste omtrek met sterke, scherp gepunte pincetten om de krassen door de dikte van het dekglas voort te planten.Gebruik een glaspunch om twee kleine gaatjes in tegenovergestelde hoeken van het ingekraste vierkant te maken. Injecteer een paar microliters precipitantoplossing via een van de gaatjes om dehydratie tijdens de volgende stappen te verminderen. Breek met een scherpe, schuine naaldsonde het glas langs één of twee zijden om het uitgesneden vierkant los te maken.Til het glazen plaatje voorzichtig op terwijl u let op de bolus van de kubische fase. Voeg indien nodig een paar extra microliters precipitant-oplossing aan, aangevuld met een cryoprotectant, bovenop de blootgestelde bolus van de kubische fase in het putje; vergroot de vergroting van de microscoop en stel scherp op een kristal. Pas de hoek tussen de polarisator en de analyzer aan om het contrast tussen het frt-kristal en de achtergrond te vergroten, terwijl er voldoende licht overblijft om de oogstlus te kunnen zien.Verwijder vervolgens het overtollige lipide en oogst het kristal direct uit de LCP door het te scheppen in een mighty gen micro mount die is geselecteerd op een diameter die overeenkomt met de kristalgrootte. Bevries de micro mount met het geoogste kristal in vloeibare stikstof en verzend deze naar een synchrotron-beamline voor röntgendata-collectie. De gemodificeerde beta two adrenergic receptor werd gelabeld met S SI three NHS ester en gebruikt in LCP Frep prec crystallisatie-assays in een automatische high-throughput modus, waarbij elk monster van een 96-wells plaat sequentieel wordt gebleekt en het fluorescentieherstel wordt gemeten na een incubatie van 30 minuten. De verkregen fluorescentieherstels, die de mobiele fractie in elk monster vertegenwoordigen, worden uitgezet voor alle 96 monsters.De screeningsoplossingen bevatten 0,1 molair tris pH 8, 30% volume/volume PEG 400, gecombineerd met 48 verschillende zouten in twee verschillende concentraties. De fluorescentieherstelprofielen voor enkele representatieve condities worden getoond. De doorlopende lijnen vertegenwoordigen fits van de genormaliseerde intensiteit versus tijd; een snel herstel van minder dan 10% in het monster dat natriumchloride bevat, is toe te schrijven aan fluorescentielabelde lipiden.Na copurificatie met het eiwit werden de eerste kristalhits van de bèta 2-adrenerge receptor in complex met olol verkregen via een grove grid-screening rond de meest veelbelovende condities geïdentificeerd door LCP Frap, bestaande uit natriumsulfaat en natriumformiaat. Verdere optimalisatie van de precipitantcondities leverde kristallen met diffractiekwaliteit op. Hier zijn de afbeeldingen van kristallen gekweekt in de aanwezigheid van natriumsulfaat en kaliumformiaat, vastgelegd in de brightfield-modus.Dezelfde kristallen kunnen ook worden bekeken met behulp van kruispolarisatoren. Zodra de techniek onder de knie is, kan de reconstitutie van proteïnen in lipide kubische fasen binnen 10 tot 15 minuten worden voltooid, en de handmatige opstelling van een kristallisatieplaat met 96 putjes binnen één uur. Een L three B wrap assay in high mode vereist ongeveer twee uur per plaat van 96 putjes, en de H crystal neemt ongeveer 10 tot 20 minuten per putje in beslag. De procedures in deze video bieden een basisgids voor het aanpakken van music kristallisatie-experimenten.Echter, zoals bij elk crystallisatie-experiment, zijn een uitgebreide screening en optimalisatie vereist, en een succesvol resultaat is niet noodzakelijkerwijs gegarandeerd.

crystallization-of-membrane-proteins-in-lipidic-mesophases

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hierin wordt beschreven de procedure geïmplementeerd in de Caffrey Membrane Structurele en Functionele Biologie Groep handmatig in te stellen tot kristallisatie onderzoeken van membraaneiwitten in lipide mesofasen.

Kristalliseren membraaneiwitten voor structuurbepaling met behulp van lipide mesofasen

Evaluatie van twee-dimensionale (2D) kristallisatie onderzoeken voor de vorming van de bestelde membraaneiwit arrays is een zeer kritische en moeilijke taak in elektron kristallografie. Hier beschrijven we onze aanpak in het screenen en identificeren van 2D-kristallen van overwegend kleine membraaneiwitten in de range van 15 - 90kDa.

Het beoordelen van twee-dimensionale Kristallisatie Trials van kleine membraaneiwitten voor Structurele Biologie Studies van Electron Kristallografie

Bicelles zijn lipide / amfifiele mengsels die membraaneiwitten (MP's) te behouden binnen een lipide bilaag, maar hebben een unieke fase gedrag dat high-throughput screening vergemakkelijkt door kristallisatie robots. Deze techniek heeft met succes geproduceerd een aantal hoge resolutie structuren van zowel prokaryotische en eukaryotische bronnen. Deze video beschrijft protocollen voor het genereren van de lipidische bicelle mengsel, waarin parlementsleden in de bicelle mengsel, het opzetten van...

High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten Met behulp van de lipidische Bicelle Method

Hierin beschreven een robot benadering high-throughput kristallisatie van membraaneiwitten in lipidische mesofasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie. Drie robots staat de behandeling van de viskeuze en kleverige eiwit beladen mesofase een integraal onderdeel van de methode worden geïntroduceerd.

Gebruik van een robot voor High-throughput Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Hierin beschreven procedures uitgevoerd in de Caffrey Membrane Biology Structurele en functionele groep te oogsten en cryo-cool membraaneiwit kristallen gegroeid lipidische kubieke spons fasen voor gebruik in structuurbepaling met macromoleculaire X-ray kristallografie.

Oogst en Cryo-koeling kristallen van membraaneiwitten Grown in lipide mesofasen voor structuurbepaling door Macromoleculaire Kristallografie

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

We beschrijven procedures voor de bereiding en aflevering van membraaneiwitmicrokristallen in lipidische kubieke fase voor seriële kristallografie bij röntgenvrije-elektronlasers en synchrotronbronnen. Deze protocollen kunnen ook worden toegepast voor de incorporatie en aflevering van oplosbare eiwitmicrokristallen, wat leidt tot een aanzienlijk verminderde sampleconsumptie in vergelijking met vloeibare injectie.

Voorbereiding en Levering van Protein Microcrystals in lipidische Cubic fase voor Serial Femtoseconde Kristallografie

Lipide monolagen worden al tientallen jaren gebruikt als basis voor het vormen van tweedimensionale (2D) eiwitkristallen voor structurele studies. Ze zijn stabiel op het lucht-water interface en kunnen dienen als een dun ondersteunend materiaal voor elektronenbeeldvorming. Hier presenteren we de bewezen stappen voor het voorbereiden van lipide monolagen voor biologische studies.

Monstervoorbereiding met behulp van een lipide monolaagmethode voor elektronenkristallografische studies

Dit protocol beschrijft een opstelling voor de kristallisatie van de steroltransporter ABCG5/G8. ABCG5/G8 wordt gereconstitueerd tot bicelles voor kristallisatie met hangende druppels. Het protocol vereist geen gespecialiseerde materialen of substraten, waardoor het toegankelijk en gemakkelijk aan te passen is in elk laboratorium voor het bepalen van de eiwitstructuur door middel van röntgenkristallografie.

ABCG5/G8-kristallisatie in een lipidenbicelle-omgeving voor röntgenkristallografie

We beschrijven een methode die de kinetiek van ionen transport van membraaneiwitten maatregelen naast locatie-specifieke analyse van conformationele veranderingen met behulp van fluorescentie op enkele cellen. Deze techniek is aanpasbaar aan ionkanalen, transporteurs en ion pompen en kan worden gebruikt om de afstand tussen de beperkingen eiwitsubeenheden te bepalen.

Het onderzoeken van de Conformationele dynamiek van membraaneiwitten In situ Met Site-directed fluorescentie Etikettering

Leer membraaneiwitkristallisatie in lipide kubische fase voor structurele biologie. Deze methode optimaliseert kristalopbrengst via LCP-FRAP screening en reconstitutie voor röntgendiffractie.

Kristallisatie van membraaneiwitten in lipide mesofasen

Meer video's verkennen