Name: Mechanische Manipulatie van Neuronen om axonale Development Controle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 2 s
Description: Leer axonale ontwikkeling bestuderen door neuronen mechanisch te manipuleren met gekalibreerde glasnaalden. Deze methode meet krachten in het microdyne-bereik tijdens axonverlenging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij dankbaar erkennen de belangrijke bijdragen van dr. Robert E. Buxbaum in de ontwikkeling van deze methodologie.

<ol><li>Zheng, J., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurements+of+growth+cone+adhesion+to+culture+surfaces+by+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurements of growth cone adhesion to culture surfaces by micromanipulation.</a> J Cell Biol. 127, 2049-2060 (1994).</li>
<li>Chada, S., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+neurite+outgrowth+from+chick+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of neurite outgrowth from chick brain neurons.</a> J Cell Sci. 110, 1179-1186 (1997).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHeidemann%2C+SR+%22The+Neuron+in+Tissue+Culture%22">The Neuron in Tissue Culture</a>. Haynes, L. W. , J. Wiley and Sons. 105-119 (1999).</li>
<li>Lamoureux, P., Altun-Gultekin, Z. F., Lin, C., Wagner, J. A., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rac+is+required+for+growth+cone+function+but+not+neurite+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Rac is required for growth cone function but not neurite assembly.</a> J Cell Sci. 110, 635-641 (1997).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159, 499-508 (2002).</li>
<li>Lamoureux, P., Heidemann, S. R., Martzke, N. R., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+elongation+within+and+along+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Growth and elongation within and along the axon.</a> Dev Neurobiol. 70, 135-149 (2010).</li>
<li>Dennerll, T. J., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytomechanics+of+axonal+elongation+and+retraction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cytomechanics of axonal elongation and retraction.</a> J Cell Biol. 109, 3073-3083 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Kaech, S., Buxbaum, R. E., Matus, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observations+of+the+mechanical+behaviors+of+the+cytoskeleton+in+living+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observations of the mechanical behaviors of the cytoskeleton in living fibroblasts.</a> J Cell Biol. 145, 109-122 (1999).</li>
<li>Yoneda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+Exerted+by+a+Single+Cilium+of+Mytilus-Edulis+.1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Force Exerted by a Single Cilium of Mytilus-Edulis .1.</a> Journal of Experimental Biology. 37, (1960).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Tension+Produced+by+Nerve-Cells+in+Tissue-Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical Tension Produced by Nerve-Cells in Tissue-Culture.</a> Journal of Cell Science. 37, 391-410 (1979).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J Neurosci. 24, 7978-7983 (2004).</li>
<li>Fass, J. N., Odde, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+force-dependent+neurite+elicitation+via+anti-beta1+integrin+antibody-coated+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Tensile force-dependent neurite elicitation via anti-beta1 integrin antibody-coated magnetic beads.</a> Biophys J. 85, 623-636 (2003).</li>
<li>Yang, S., Saif, M. T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+Force+Sensors+and+Their+Applications+in+the+Study+of+Cell+Mechanical+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mech%22%5BJournal%5D)">Microfabricated Force Sensors and Their Applications in the Study of Cell Mechanical Response.</a> Exp Mech. 49, 135-151 (2009).</li>
<li>Bernal, R., Melo, F., Pullarkat, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drag+Force+as+a+Tool+to+Test+the+Active+Mechanical+Response+of+PC12+Neurites%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Drag Force as a Tool to Test the Active Mechanical Response of PC12 Neurites.</a> Biophysical Journal. 98, 515-523 (2010).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+that+growth+cones+pull%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct evidence that growth cones pull.</a> Nature. 340, 159-162 (1989).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+cone+behavior+and+production+of+traction+force%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth cone behavior and production of traction force.</a> J Cell Biol. 111, 1949-1957 (1990).</li>
<li>O'Toole, M., Lamoureux, P., Miller, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+axonal+elongation%3A+force%2C+viscosity%2C+and+adhesions+govern+the+mode+of+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">A physical model of axonal elongation: force, viscosity, and adhesions govern the mode of outgrowth.</a> Biophys J. 94, 2610-2620 (2008).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Ngo, K., Reynolds, M., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-dish+incubator+for+live+cell+imaging+with+an+inverted+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Open-dish incubator for live cell imaging with an inverted microscope.</a> Biotechniques. 35, 708-708 (2003).</li>
</ol>

Technieken toe te passen en te meten cellulaire krachten hebben een lange geschiedenis 9. Onze methode werd oorspronkelijk ingegeven door het werk van Dennis Bray, die vroeger glas naalden vergelijkbaar met die van ons met &#39;slepen&#39; neuronen met een constante snelheid met behulp van een gemotoriseerd hydraulische inrichting 10. Er zijn veel alternatieve middelen van de toepassing van krachten om cellen die onder andere: stappenmotoren 11, 12 magnetische korrels, microfabricated ba...

<table><tbody><tr><td>R-6 capillaire buis</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3111</td><td>R-6 glas OD 0.9mm, ID 0.6 mm, 8&quot;</td></tr><tr><td>BB-CH puller</td><td>Mecanex S.A., Genève, Zwitserland</td><td>BB-CH puller</td><td>Gebruik Mode 4 Alt bij CP=100, PP=10, SP1=1000, SP2=1000</td></tr><tr><td>0.001&quot; Chromel-draad</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCH-001-50</td><td>ongeïsoleerde thermokoppeldraad, spoel van 50ft, nu bekend als Chromega</td></tr><tr><td>0.003&quot; Constatan-draad</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>SPCI-003-50</td><td>ongeïsoleerde thermokoppeldraad, spoel van 50 ft</td></tr><tr><td>fijne pincet</td><td>Fine Science Tools</td><td>91150-20</td><td>Dumont Inox #5</td></tr><tr><td>universele microscooparmstatief</td><td>Nikon Instruments</td><td>76135 of 90430</td><td>de meeste merken of typen armstatieven zijn geschikt voor dit gebruik</td></tr><tr><td>mechanische micromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>M-152</td><td>direct-drive grove micromanipulator met drie assen</td></tr><tr><td>hydraulische micromanipulator</td><td>Narishige International</td><td>MO-203</td><td>nu beschikbaar als MMO-203, type met drie beweegbare assen</td></tr><tr><td>naaldhouder</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520145</td><td>set van 3</td></tr><tr><td>enkelvoudige instrumenthouder</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520142</td><td></td></tr><tr><td>dubbele instrumenthouder</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520143</td><td></td></tr><tr><td>mechanische micromanipulator</td><td>Leica Microsystems</td><td>39430001</td><td>paalmontage, 1 probehouder, RH Model 430001</td></tr><tr><td>joystick mech. micromanipulator</td><td>Leica Microsystems</td><td>11520137</td><td></td></tr><tr><td>Leica DM IRB</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>omgekeerde microscoop</td></tr><tr><td>Vibraplane isolatietafel</td><td>Kinetic Systems</td><td>1200 serie</td><td>ons model is 1201-02-12</td></tr><tr><td>Ringcubator</td><td>Zelfgebouwd (zie referentie 19)</td><td></td><td>referentie 19, vereist bijgewerkte controller zoals hieronder vermeld</td></tr><tr><td>programmeerbare temperatuurcontroller</td><td>Instrumart.com</td><td>Fuji Electric PXR3</td><td>vervangt de uitgefaseerde PXV3 temperatuurcontroller</td></tr><tr><td>Nikon Diaphot TMD</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>omgekeerde microscoop, circa 1980</td></tr><tr><td>Nikon SMZ-10 binoculair dissectiemicroscoop</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td>andere dissectiemicroscopen zijn ook geschikt</td></tr></tbody></table>

mechanische manipulatie van neuronen om axonale development controle

Mechanical Manipulation of Neurons to Control Axonal Development

Cel manipulaties en uitbreiding van de neuronale axonen kan worden bereikt met gekalibreerde glazen micro-vezels geschikt voor het meten en toepassen van krachten in van 10-1000 μdyne range 1,2. Force metingen worden verkregen door observatie van de Hookean buigen van het glas naalden, die worden gekalibreerd door een directe en empirische methode 3. Apparatuur eisen en procedures voor het fabriceren, kalibreren, behandelen, en het gebruik van de naalden op cellen worden volledig beschreven. De kracht regimes eerder gebruikte en de verschillende celtypes waarop deze technieken zijn toegepast tonen de flexibiliteit van de methodologie en worden gegeven als voorbeelden voor toekomstig onderzoek 4-6. De technische voordelen zijn de continue &#39;visualisatie&#39; van de krachten die door de manipulaties en de mogelijkheid om rechtstreeks in te grijpen in een verscheidenheid van cellulaire gebeurtenissen. Deze omvatten directe stimulatie en regulering van de axonale groei en terugtrekking 7, evenals onthechting en mechanische metingen op elk type van de gekweekte cellen 8.

Toepassing en directe metingen van de krachten op neuronen in de 2-1000 microdyne serie worden bereikt met een hoge precisie met geijkte glas naalden. Deze methodiek kan gebruikt worden om de controle en meten van verschillende aspecten van axonale ontwikkeling, waaronder axonale initiatie, axonale spanning, snelheid van axonale rek, en kracht vectoren.

Mechanische Manipulatie van Neuronen om axonale Development Controle

Celmanipulaties en de verlenging van neuronale axonen kunnen worden uitgevoerd met gekalibreerde glazen microvezels die in staat zijn om krachten te meten en uit te oefenen in de ...

Het doel van dit experiment is om een axon te verlengen terwijl de krachten nauwkeurig worden gemeten. Dit wordt bereikt door een direct gekalibreerde referentienaald van draad te maken waarna, na kalibratie van de referentienaald, gekalibreerde, intermediaire en werknaalden in het gewenste krachtbereik worden voorbereid. Vervolgens worden groeikegels met een werknaald voortgetrokken om een axon te verlengen.De resulterende axonale verlenging wordt geregistreerd en krachten worden gemeten op basis van de buiging van de gekalibreerde naald. Deze methode kan belangrijke vragen beantwoorden over de biofysica van axonale verlenging. Begin deze procedure door een instelbare micronaalden-trekker en glazen capillaire buizen te gebruiken om naalden te vervaardigen met taps toelopende punten van ongeveer vier millimeter lang.Bewaar de naalden in een afgedekte Petrischaal van 160 millimeter. Maak vervolgens een kalibratienaald van draad door een chromal-draad van 0,001 inch door de binnenkant van een glazen naald met een afgebroken punt te steken. Trek de draad tot een lengte van 26 millimeter uit de punt en lijm deze op zijn plaats met secondelijm.Buig de distale ene millimeter van de draad tot een haakje. Vervolgens worden microwichten gemaakt van één meter 0,003 inch constante draad. Plak de draad aan een meetlat om deze te meten.Om te helpen het zo recht mogelijk te krijgen. Weeg het draad van één meter en knip het nauwkeurig in stukken van één centimeter. Buig verschillende stukken van het draad in de vorm van een vaas.Voor het kalibreren van de draadnaalden is een dissectiemicroscoop met een verticale meetlat en een micromanipulator vereist. De microscoop wordt 90 graden op zijn zijkant gekanteld. Gebruik hiervoor een universele statiefarm, zodat de neerwaartse afbuiging van de draadnaald kan worden waargenomen.Bevestig de draadnaald in een gereedschapshouder op een micromanipulator, zodat deze loodrecht op de optische as van de microscoop staat. Lijn de haak van de draadnaald uit met een radiaal markeerpunt. Hang het microgewicht van één centimeter aan de haak en noteer de afbuiging.De buigingsconstante van de referentiedraad is gelijk aan de massa van het microwicht gedeeld door de waargenomen uitwijking. Bereid na het kalibreren de naald voor op de volgende stap door de haak bij het waypoint met het scheermesje af te snijden om de tussenliggende glazen naalden te kalibreren. Een omgekeerde microscoop met een oculairmeetschijf is vereist.Aan één zijde van de microscooptafel bevindt zich een mechanische micromanipulator die wordt gebruikt om de draadnaald vast te houden. Aan de andere zijde bevindt zich een hydraulische micromanipulator die wordt gebruikt om de tussenliggende glazen naald te bewegen. Kalibreer deze door middel van de micromanipulatoren en breng beide naalden in het centrum van het optische veld samen onder een hoek van 45 graden in een Petri-schaal van 160 millimeter bij 30 millimeter met water bij een 10x vergroting. Voer vervolgens een reeks deflecties uit voor elk van deze deflecties.Noteer de initiële afbuiging en de uiteindelijke nulbelastingspositie van de glazen naald na het loslaten. Dit levert 10 paren datapunten op. Om de 10 dataparen voor te bereiden voor een lineaire regressie, wordt de initiële afbuiging afgetrokken van het tweede getal van de geregistreerde paren.Voeg vijf controleparen van nul nul toe aan de 10 experimentele dataparen om de lineaire regressie te verankeren bij nul, wat overeenkomt met nul doorbuiging bij nul kracht. Bereken de lineaire regressie met deze 15 dataparen.De veerconstante van de intermediaire glazen naald is gelijk aan de bekende buigconstante van de draadnaalden gedeeld door de helling van de regressielijn. Kalibreer vervolgens de werkende glazen naalden ten opzichte van de intermediaire glazen naald zoals zojuist beschreven. Glazen naalden met een afmeting van minder dan twee micron per micrometer kunnen enigszins worden ingekort om ze binnen een geschikt stijfheidsbereik te brengen.Druk de naalden die gecoat moeten worden in de zijkant van een klomp klei die boven een bekerglas van 10 milliliter met de hechtaanname-oplossing wordt gehouden, zodanig dat na elkaar alleen de naaldpunt in de oplossing wordt gedoopt. Dompel de naalden gedurende 30 minuten in een 0,1% polylysine-oplossing. Dompel de naalden vervolgens 30 minuten lang in conval en a terwijl de naald wordt behandeld met hechtingsfactoren.Zet de incubator of het verwarmingssysteem van de microscooptafel aan, zodat de tafel in thermisch evenwicht komt. Het sleepstation op een trillingsisolatietafel bestaat uit een omgekeerde microscoop, uitgerust met een hydraulische manipulator die een uitgebalanceerde, op maat gemaakte extensie vasthoudt waarin de dubbele gereedschapshouder is geplaatst.Plaats een ongekalibreerde referentienaald in een naaldhouder, zodat deze zo ver mogelijk uitsteekt. Plaats deze samenstelling in de rechterzijde van de dubbele gereedschapshouder. Plaats vervolgens de behandelde werknald in een naaldhouder, zodat deze tot de helft van de lengte van de referentienaald uitsteekt, en plaats deze in de linkerzijde van de dubbele gereedschapshouder.Stel de hydraulische micromanipulator zo in dat de verticale bediening volledig omhoog staat. Breng vervolgens de twee naaldpunten bij elkaar met behulp van de zijwaartse stelschroef. Positioneer de naald.Controleer vervolgens of de punten gelijk staan door het paar vanaf de zijkant visueel te inspecteren en gebruik de boven- en onderschroef aan de rechterkant om de punten in hetzelfde vlak te brengen. Draai de gereedschapshouder en plaats de naaldpunten in het lichtpad boven het oppervlak van het medium. Lijn ze steil naar beneden uit.Draai de kogelgewrichtschroef aan de basis vast. Focus omhoog boven de cellen op de bodem van het schaaltje terwijl u kijkt met het 10 x objectief. Laat de naalden in het medium zakken om de naaldpunten in het gezichtsveld van de microscoop te vinden.Voordat u ze te ver in de kweekschaal brengt, beweegt u de naald heen en weer naar achteren of voren en zoekt u naar de schaduw ervan. Zodra een naald in zicht is, draait u aan de zijdelingse schroef om vast te stellen welke naald is gevonden.Als deze meebeweegt met de schroef, is het de referentienaald. Als dit niet het geval is, is het de gekalibreerde naald. Wanneer beide naalden zijn gelokaliseerd, gebruik dan de fijne instellingen van de dubbele gereedschapshouder om ze uit te lijnen.Het doel is om de naaldpunten ongeveer 50 micrometers uit elkaar te plaatsen, wat ongeveer een inch op de monitor komt. De referentie moet zich hoger boven de kweekschaal bevinden en is daarom enigszins onscherp. Wanneer de sleepnaald scherp is gesteld op de schaal, wordt het beeld van deze definitieve afgestelde positie vastgelegd.De scheiding van de naalden is de nulreferentieafstand. Til de naalden boven het vlak van het preparaat en parkeer ze aan de rand van het gezichtsveld. Kies een experimenteel axon aan de hand van de richtlijnen in het schriftelijke protocol.Verplaats de naalden dicht bij de groeikegel van het axon en registreer opnieuw de nulafstand. Zet vervolgens de trillingsisolatietafel op lucht om een groeikegel op de naald te manipuleren. Plaats de sleepnaald naast de groeikegel eronder en laat de naald vervolgens zakken tegen de bodem van de schaal.Hierdoor zal de naald omhoog buigen, waardoor deze langs de schaal in de groeikegel glijdt, om vervolgens de groeikegel los te maken en omhoog te bewegen. Druk de naald net genoeg tegen de bodem van de schaal zodat de groeikegel zich rond de naaldpunt hakt, maar niet zo ver dat deze over de naald glijdt en naar achteren schuift. Wacht 20 minuten zodat de grip zich kan vestigen.Zodra de groeikegel zich op de naald bevindt, wordt er een lichte spanning op uitgeoefend. Door de naald naar rechts te bewegen en deze lichtjes op te tillen, wordt de neerwaartse beweging van de naald gecompenseerd door deze tijdens het optillen een beetje naar voren te bewegen. Til de naald in stappen op totdat het aangehechte uitsteeksel loodrecht vanaf de naald en boven het oppervlak van de schaal uitsteekt. Het sleuren wordt voltooid door de naalden van het cellichaam af te bewegen.In kleine stappen worden de krachten waargenomen als een toenemende afstand tussen de naalden terwijl de spanning geleidelijk wordt verhoogd. Let nauwkeurig op eventuele tekenen dat de groeikegel loslaat van de naald. Houd het medianiveau in de schaal op peil door elk uur water toe te voegen om verdamping te compenseren.Gebruik een markering aan de zijkant van de schaal om de initiële diepte aan te geven; voeg aan het einde van een experiment langzaam water toe langs de zijkant van de schaal, weg van de naalden, met behulp van een pipet. Controleer de nulafstand opnieuw voordat u de naalden uit de schaal tilt. Lees de posities van de naalden langs de horizontale as op het scherm af.Registreer daarnaast de positie van het cellichaam en de tijdstippen waarop de afstand tussen de naalden minus de onbelaste nulafstand, vermenigvuldigd met de buigingsconstante van de naald, gelijk is aan de uitgedrukte kracht in microns. Getoond. Hier is een voorbeeldveld van cellen met verschillende mogelijke keuzes voor het beheersen van de axonale ontwikkeling. Het horizontale axon met een grote groeikegel is een goede selectie.Het cellichaam wordt nabij de rand van het scherm geplaatst en de naalden worden dicht bij de groeikegel gebracht. Er wordt een afbeelding gemaakt van de afstand tussen de naalden zonder belading; dit is de nulafstand. Voordat het experiment begint, wordt de treknaald tegen de groeikegel geplaatst om te kijken of er een spontane hechting kan worden bereikt.Vervolgens wordt de naald iets verder in de groeikegel geduwd. De 'push-up' manoeuvre wordt uitgevoerd door de naald tegen de bodem van de schaal te laten zakken, waardoor de naald buigt en in de groeikegel glijdt, waardoor deze loskomt. Er is ook een kleine toename van de voorwaartse spanning toegevoegd.Na 15 minuten lijkt het axon te zijn uitgerekt door de voorwaartse beweging van de naald. Vervolgens wordt er meer spanning op de trekkende naald gezet en begint het omhoog tillen van de naald. Er wordt extra spanning toegevoegd, wat blijkt uit de toenemende afstand tussen de naalden.Op dit punt is duidelijk te zien dat het axon uitgroeit. De referentienaald is niet naar voren bewogen, maar het axon is in de richting daarvan gegroeid, waardoor de spanning is afgenomen. Daarnaast zijn de naalden iets opgetild.Hier wordt nog meer spanning toegevoegd aan de sleepnaald. Er heeft aanzienlijke groei plaatsgevonden als reactie op de spanning die op de gebogen sleepnaald is uitgeoefend. Aan het einde van het experiment wordt een laatste nulcontrole uitgevoerd.Het gehele proces wordt gedemonstreerd in deze time-lapse reeks. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u naalden kalibreert, een groeikegel op een naald manipuleert en de krachten meet tijdens het uitrekken van een axon.

mechanical-manipulation-of-neurons-to-control-axonal-development

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Een unieke tissue engineering methode werd ontwikkeld om een ​​groot aantal zenuwvezels in de cultuur langwerpig door indient axon stretch groei, een vorm van het zenuwstelsel waarbij de groei van zenuwen langwerpig in combinatie met een groei van de zich uitbreidende lichaam.

Axon Stretch groei: de Mechanotransductie van neuronale groei

Genetische Studie van de regeneratie van axonen met gekweekte volwassen dorsale wortel ganglion neuronen

Neuronale morfogenese en migratie zijn cruciale gebeurtenissen ten grondslag liggen aan een goede ontwikkeling van de hersenen. Hier beschrijven we methoden om genetisch manipuleren gekweekte cerebellaire granule neuronen en de ontwikkelingslanden cerebellum voor de beoordeling van de morfologie en trekkende kenmerken van neuronen.

Genetische Manipulatie van Cerebellaire Korrel Neuronen<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em&gt; Om te studeren Neuronale morfologie en Migratie

Twee-foton beeldvorming, gekoppeld aan laser nanodissection, zijn nuttige hulpmiddelen om degeneratieve en regeneratieve processen te bestuderen in het centrale zenuwstelsel met subcellulaire resolutie. Dit protocol laat zien hoe u een label, afbeelding en ontleden enkele klimmen vezels in de cerebellaire schors in vivo.

Laser nanosurgery van Cerebellar Axonen<em&gt; In Vivo</em

Lichtmicroscooptechnieken gekoppeld aan biochemische analyses verduidelijken de betrokkenheid van SNARE-gemedieerde exocytose bij netrine-afhankelijke axonvertakking. Deze combinatie van technieken maakt identificatie mogelijk van moleculaire mechanismen die axonvertakking en celvormverandering controleren.

Gebruik makend van gecombineerde methoden om de rol van de plasmamembraan Delivery Tijdens Axon vertakking en neuronale Morphogenesis Definieer

Dit protocol beschrijft de isolatie van dorsale wortelganglion (DRG) neuronen geïsoleerd uit ratten en de kweek van DRG neuronen op een statisch voorgerekt celkweeksysteem om de uitlijning van axonen te verbeteren, met daaropvolgende co-cultuur van Schwann-cellen (SC's) om myelinisatie te bevorderen.

Een aanpak ter verbetering van Alignment en Myelination van dorsale wortel ganglion Neuronen

Dit manuscript bevat informatie over de fabricage van micro-tissue-gemanipuleerde neurale netwerken: driedimensionale micron-grootte constructies die bestaan ​​uit lange uitgelijnd axonale tracten die de geaggregeerde neuronale populatie (n) in een buisvormige hydrogel bekleden. Deze levende steigers kunnen dienen als functionele relais om neurale circuits te reconstrueren of te moduleren of als biofidelische testbedden die grijze-witte materie-neuroanatomie nabootsen.

Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

Deze procedure beschrijft hoe snel neurieten georganiseerd in microfluïdische kamers kunnen initiëren, verlengen en verbinden met behulp van poly-D-lysine beklede kralen die zijn bevestigd aan micropipetten die leiden tot neuriet verlenging.

Rewiring Neuronal Circuits: een nieuwe methode voor snelle neuritische verlenging en functionele neuronale verbinding

Neriet-uitgroeianalyses bieden een kwantitatieve waarde over regeneratieve neuronale processen. Het voordeel van deze semi-automatische software is dat het cellichamen en neurieten afzonderlijk segmenteert door een masker te maken en verschillende parameters meet, zoals neurietlengte, aantal vertakkingspunten, cel-lichaamclusteroppervlak en aantal celclusters.

Standaardisatie van een nieuwe semi-automatische software voor het meten van de uitgroei van je nauriet 

Dit protocol beschrijft een microfluïdisch systeem dat neuronale metabole dynamiek modelleert na axonale verwonding, waardoor beeldvorming, multi-omics-analyse en mechanistische studies van intrinsieke metabole remodellering mogelijk zijn.

Microfluïdische chip voor axonale letselmodellen, constructie en het mogelijk maken van multi-omics-analyse

Leer axonale ontwikkeling bestuderen door neuronen mechanisch te manipuleren met gekalibreerde glasnaalden. Deze methode meet krachten in het microdyne-bereik tijdens axonverlenging.

Mechanische Manipulatie van Neuronen om axonale Development Controle

Meer video's verkennen