Bio-energetische Profiel Experiment met behulp van C2C12 myoblast Cellen

Het algemene doel van het volgende experiment is om de functionele status van mitochondriën in levende cellen en geïsoleerde mitochondriën te testen door meerdere parameters van het oxidatieve metabolisme te meten met behulp van de XF 96 extracellular flux analyzer. Deze parameters zijn de basale respiratie, ATP-omzetting, protonlek en de maximale respiratie of reserve-respiratoire capaciteit. Dit wordt bereikt door sequentieel specifieke modulatoren van de mitochondriale respiratie toe te voegen aan C2C12-myoblastcellen en de verandering in de zuurstofconsumptiesnelheid, of OCR, te meten, een indicator van respiratie, de omzetting van glucose naar lactaat, wat ATP genereert via glycolyse.

Het andere belangrijke energiepad in cellen wordt gemeten als ECAR of de extracellulaire acidificatiesnelheid. Er kunnen resultaten van mitochondriële profilering worden verkregen die inzicht geven in de centrale rol die de mitochondriële functie speelt bij het bepalen van de levensduur van cellen. Hallo, mijn naam is David Nichols.

Gedurende mijn hele carrière ben ik een mitochondriale kunstenaar geweest en het belangrijkste instrument dat ik in mijn studies heb gebruikt, is de zuurstofelektrode. Als je de snelheid van de zuurstofopname onder verschillende omstandigheden met geïsoleerde mitochondriën kunt meten, verkrijg je een enorme hoeveelheid cruciale informatie. Wanneer je overstapt op cellen, vooral cellen die zijn gekweekt in een multi-well plaat of op een dekglas, werken de klassieke methoden niet.

Dit is een groot probleem, dat een paar jaar geleden werd opgelost door de ontwikkeling van een multi-well plate assay, waarmee we de respiratie van cellen parallel in een multi-well plate-formaat kunnen bestuderen. Wat u vandaag zult zien is een zeer eenvoudig maar informatierijk experiment, dat we hebben ontworpen om de basisbio-energetische mitochondriale functie in gecultiveerde cellen te monitoren. Begin met het uitplaten van de cellen in XF 96 celkweekplaten met 10.000 cellen per well in 100 µL groeimedium en plaats deze in een incubator van 37 °C met 10% CO2.

De cellen kunnen in de XF 96 worden geanalyseerd, 24 uur na het uitplaten met behulp van de assay. De Wizard genereert een sjabloon met de volgende groepsindeling. Kolommen één tot en met 12 bevatten elk 10.000 C two C 12 cellen.

Groep één in het blauw wordt gebruikt als controlecellen. Groep twee in het rood krijgt de medicijnen oligomycine, FCCP en rotenon toegediend. Bereid vervolgens de verbindingen voor in X-F-D-M-E-M assaymedium, zoals beschreven in het schriftelijke gedeelte van het protocol.

Oligomycine, FCCP en rotenoon. Deze verbindingen zijn vooraf gedoseerd in de XF cell MIT stress test kit. Vervang met behulp van het XF prep station het groeimedium door DMEM loopmedium.

Incubeer de cellen tot slot gedurende 60 minuten in een incubator van 37 °C zonder koolstofdioxide, zodat de cellen kunnen pre-equilibreren met het assay-medium. Warm de injecteerbare verbindingen op tot 37 °C voordat u deze in de sensorkartridge toevoegt. Laad ze vervolgens als volgt in de injectorpoorten. Laad voor kolommen één tot en met vier respectievelijk 16, 18 en 20 µL XF assay-medium of DMEM in poorten A, B en C.

Laad voor kolommen vijf tot en met 12 16 µL oligamycine in poort A, 18 µL FCCP in poort B en 20 µL rotenon in poort C. Definieer vervolgens de protocolcommando's: stel de lus in op drie keer, meng gedurende drie minuten en meet gedurende drie minuten. Klik daarna op start.

Volg de instructies op het scherm die de gebruiker aangeven wanneer de cartridge geplaatst moet worden zodra de kalibratie is voltooid. Volg de aanwijzingen voor de gebruiker en voeg de celplaat voor het experiment toe. Klik vervolgens op doorgaan en laat de assay lopen.

Verwijder de plaat wanneer het experiment is beëindigd. Deze assay is afgeleid van het klassieke experiment om de mitochondriële functie te profileren en dient als kader voor het opzetten van complexere experimenten die gericht zijn op het begrijpen van diverse effecten van verbindingen op het celmetabolisme, de mitochondriële functie en de algemene bio-energetische activiteiten. Hier observeerden we de verwachte respons in de zuurstofconsumptiesnelheid nadat de cellen waren behandeld met elke opeenvolgende verbinding.

Voor ligamycine nam de OAR af als gevolg van het blokkeren van de ATP-synthese bij mitochondriaal complex vijf. Aangezien de cellen na een behandeling met ligamycine geen ATP konden synthetiseren via oxidatieve fosforylering, schakelden ze over op glycolyse om aan hun behoefte aan ATP te voldoen. Hierdoor observeerden we een toename in de ECAR, de extracellulaire verzuringssnelheid, een indicator voor glycolyse zoals eerder aangetoond. FCCP werkt als ontkoppelingsmiddel en heft de beperking van de protonenterugkeer op.

De respiratie versnelt en wordt nu beperkt door het elektronentransport. Ten slotte remt rotenon het mitochondriële complex I, waardoor de elektronenstroom in de elektronentransportketen stopt en het zuurstofverbruik drastisch wordt verminderd. Hierdoor wordt informatie verkregen over de basale respiratie van de cellen, het percentage van het zuurstofverbruik dat bestemd is voor ATP-productie, alsof welk deel bestemd is voor het in stand houden van de protonengradiënt als gevolg van protonlekkage.

Verder kunnen we de maximale ademhalingssnelheid bepalen onder omstandigheden van ontkoppelde respiratie, wat soms wordt aangeduid als de reserve-respiratoire capaciteit. En tot slot kunnen we de hoeveelheid zuurstofverbruik bepalen die niet te wijten is aan mitochondriale processen. Dit heeft u zojuist gezien met de Seahorse.

XF 96, een reeks experimenten die een enorme hoeveelheid informatie verschaft over de bioenergetica van de mitochondriën in de cel. Het basisexperiment, dat zo belangrijk is en dat we experiment nummer één noemen, geeft informatie over de basale respiratie, ATP-omzetting, mitochondriaal protonlekkage en de reserve-respiratoire capaciteit. Deze parameters bieden fundamentele informatie over de bioenergetische status van de mitochondriën in de cel.