Name: Bio-energetische Profiel Experiment met behulp van C2C12 myoblast Cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-06T16:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: Leer bio-energetisch profielonderzoek met C2C12-myoblastcellen met de XF 96-analyzer. Deze methode meet mitochondriale ademhaling, ATP-koppeling en protonlek voor inzicht in cellulaire metabolisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

In dit experiment worden C2C12 myoblast cellen gezaaid bij een bepaalde dichtheid in Seahorse celkweek platen. De basale zuurstofverbruik (OCR) en extracellulaire verzuring (ECAR) tarieven zijn gemeten met de uitgangswaarde tarieven vast te stellen. 1. Cellen Injectie De cellen zijn metabolisch verstoord door drie toevoegingen van verschillende verbindingen (achter elkaar) dat de bio-energetische profiel van de cel shift. De ene groep zal dienen als de controle, met het runnen van media toegevoegd als controle "verbindingen". <ol><li> De eerste injectie is oligomycin. Oligomycin remt de ATP-synthese door het blokkeren van de proton-kanaal van de F-o gedeelte ATP synthase (Complex V). In het mitochondriaal onderzoek, wordt het gebruikt om de staat 3 (fosforylerende) ademhaling te voorkomen. Met cellen, kan het worden gebruikt om het percentage van O2-verbruik gewijd aan de ATP synthese en het percentage van de O2-verbruik nodig is om de natuurlijke proton lek in het binnenste mitochondriale membraan te overwinnen onderscheiden. </li><li> De tweede injectie is FCCP. FCCP (Carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenylhydrazone) is een ionofoor dat is een mobiele ion drager. Het is een ontkoppeling agent omdat het ATP-synthese verstoort door het transport van waterstof-ionen in het mitochondriale membraan in plaats van het proton kanaal van ATP synthase (Complex V). Deze ineenstorting van de mitochondriale membraanpotentiaal leidt tot een snelle verbruik van energie en zuurstof, zonder het genereren van ATP. In dit geval zullen zowel de OCR en ECAR te verhogen, OCR als gevolg van ontkoppeling, en ECAR als de cellen poging om hun energie-evenwicht te bewaren met behulp van de glycolyse om ATP te genereren. FCCP behandeling kan worden gebruikt om de "vrije" respiratoire capaciteit van de cellen die wordt gedefinieerd als het kwantitatieve verschil tussen de maximale ongecontroleerd OCR en de eerste basale OCR te berekenen. Het is voorgesteld dat het behoud van enige reservecapaciteit respiratoire capaciteit, zelfs onder omstandigheden van maximale fysiologische of pathofysiologische stimulus is een belangrijke factor het bepalen van de vitaliteit en / of de overleving van cellen. Het vermogen van cellen om te reageren op stress onder omstandigheden van verhoogde vraag naar energie is in een groot deel beïnvloed door de bio-energetische capaciteit van de mitochondriën. Deze bio-energetische capaciteit wordt bepaald door verschillende factoren, waaronder het vermogen van de cel om substraat te leveren aan mitochondria en de functionele capaciteit van enzymen die betrokken zijn in het elektron transport </li><li> In de derde injectie, is rotenon, een Complex I-remmer, toegevoegd aan de cellen. Het programma wordt afgesloten mitochondriale ademhaling en maken zowel de mitochondriale en niet-mitochondriale fracties bij te dragen aan de ademhaling worden berekend. Men zal zich aan een afname van de OCR te wijten aan een verminderde mitochondriale functie, met een gelijktijdige verhoging van ECAR als de cel verschuift naar een meer glycolytische staat om de energie-evenwicht te handhaven Rotenon is een mitochondriaal inhibitor dat de overdracht van elektronen van de Fe-S-centrum in Complex I tot en met ubiquinon (Co-enzym Q) voorkomt. Deze remming van het Complex I voorkomt dat de potentiële energie in NADH worden geconverteerd naar bruikbare energie in de vorm van ATP. </li></ol> 2. Reagentia en materialen <ol><li> Oligomycin, FCCP, en Rotenon Solutions (Seahorse Mito Stress Test Kit) </li><li> DMEM Running Media (Seahorse # 100965-000) </li><li> DMSO (Sigma D8418) </li><li> Gedestilleerd water (Gibco 15230-170) </li><li> Kalibratie buffer (Seahorse Bioscience) </li></ol> 3. Groeimedium <ol><li> 500 ml DMEM (Gibco 11965-092) </li><li> 10% FBS (Hyclone SH90070.03) </li><li> 5 ml Penn / Strep (Gibco 15.140 tot 122) </li><li> 5 ml natriumpyruvaat (Sigma S8636) </li><li> 5 ml Glutamax (Gibco 35050-061) </li></ol> 4. Zaaien Protocol <ol><li> Cellen worden uitgezaaid in XF96 celculturen platen met 10.000 cellen / putje in 100 ul van groeimedium en geplaatst in 37 ° C incubator met 10% CO 2. </li><li> Cellen zullen zich houden aan de XF96 celcultuur plaat binnen 1 uur. </li><li> Assay cellen in XF96 24 uur na zaaien. </li></ol> 5. Voorbereiding van de Assay Template <ol><li> Met behulp van de Wizard Assay (bijlage I), het genereren van een sjabloon met de volgende groep lay-out: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Well rooster lay-out te identificeren kolom en groepsopdrachten </li></ol> 6. Compound Voorbereiding <ol><li> Bereid de volgende verbindingen in de XF DMEM Assay media als volgt: 10 uM Oligomycin, 30,0 uM FCCP, 20,0 uM Rotenon, Deze concentraties vertegenwoordigen de 10x verdunning die zullen worden gemaakt wanneer de verbindingen worden geïnjecteerd in de put. De werkende concentraties zijn: 1 uM Oligomycin, 3,0 uM FCCP, 2,0 uM Rotenon </li></ol> 7. Media Verandering en celpreparaat <ol> Plaats de cel plaat op de XF Prep Station <li> Stel het uiteindelijke volume van de middelgrote tot 160 ul per putje. </li><li> Incubeer in 37 ° C incubator zonder CO 2 gedurende 60 minuten om cellen te pre-evenwicht met de voedingsbodem. </li></ol> 8. Het laden van Sensor Cartridge <ol><li> Warm verbindingen tot 37 ° C vóór het laden sensor cartridge en de verbindingen in de injector poorten als volgt laden: <ol><li> Kolommen 1-4: Load 16, 18, en 20 ul van XF Assay media (DMEM) in havens A, B en C, respectievelijk. </li><li> Kolommen 5-12 jaar: Belasting 16 pi van Oligomycin in havens A Belasting 18 pi van FCCP in havens B Belasting 20 ul van Rotenon in havens C </li></ol></li></ol> 9. Protocol Commando's <table border="1"><tbody><tr><td> Commando </td><td> Tijd (min) </td><td> Poort </td></tr><tr><td> Kalibreren </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Evenwicht </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 3X </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Wacht </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Meten </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Loop End </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Injecteren </td><td></td><td> Een </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Wacht </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Meten </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Injecteren </td><td></td><td> B </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Wacht </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Meten </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Injecteren </td><td></td><td> C </td></tr><tr><td> Loop Start </td><td> 2X </td><td></td></tr><tr><td> Mengen </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Wacht </td><td> 2 </td><td></td></tr><tr><td> Meten </td><td> 3 </td><td></td></tr><tr><td> Einde </td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Protocol commando's

<ol><li>Choi, W. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+analysis+of+isolated+cerebrocortical+nerve+terminals+on+a+microgram+scale%3A+spare+respiratory+capacity+and+stochastic+mitochondrial+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic analysis of isolated cerebrocortical nerve terminals on a microgram scale: spare respiratory capacity and stochastic mitochondrial failure.</a> J Neurochem. 109, 1179-1191 (2009).</li>
<li>Hill, B. G., Dranka, B. P., Zou, L., Chatham, J. C., Darley-Usmar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+the+bioenergetic+reserve+capacity+in+response+to+cardiomyocyte+stress+induced+by+4-hydroxynonenal%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Importance of the bioenergetic reserve capacity in response to cardiomyocyte stress induced by 4-hydroxynonenal.</a> Biochem J. 424, 99-107 (2009).</li>
<li>Liu, J., Cao, L., Chen, J., Song, S., Lee, I. H., Quijano, C., Liu, H., Keyvanfar, K., Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bmi1+regulates+mitochondrial+function+and+the+DNA+damage+response+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Bmi1 regulates mitochondrial function and the DNA damage response pathway.</a> Nature. , 459-7245 (2009).</li>
<li>Malmgren, S., Nicholls, D. G., Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., Wibom, R., Groop, L., Ling, C., Mulder, H., Sharoyko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+coupling+between+glucose+and+mitochondrial+metabolism+in+clonal+beta-cells+is+required+for+robust+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Tight coupling between glucose and mitochondrial metabolism in clonal beta-cells is required for robust insulin secretion.</a> J Biol Chem. 284, 32395-32404 (2009).</li>
<li>Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+reserve+capacity+in+endothelial+cells%3A+The+impact+of+nitric+oxide+and+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species.</a> Free Radic Biol Med. 48, 905-914 (2010).</li>
<li>Perez, J., Hill, B. G., Benavides, G. A., Dranka, B. P., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+bioenergetics+in+smooth+muscle+cell+proliferation+induced+by+platelet-derived+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Role of cellular bioenergetics in smooth muscle cell proliferation induced by platelet-derived growth factor.</a> Biochem J. 428, 255-267 (2010).</li>
<li>Morán, M., Rivera, H., Sánchez-Aragó, M., Blázquez, A., Merinero, B., Ugalde, C., Arenas, J., Cuezva, J. M., Martín, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+bioenergetics+and+dynamics+interplay+in+complex+I-deficient+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial bioenergetics and dynamics interplay in complex I-deficient fibroblasts.</a> Biochim Biophys Acta. , 1802-185 (2010).</li>
<li>Cárdenas, C., Miller, R. A., Smith, I., Bui, T., Molgó, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+regulation+of+cell+bioenergetics+by+constitutive+InsP3+receptor+Ca2%2B+transfer+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria.</a> Cell. , 142-142 (2010).</li>
</ol>

Min Wu, Per Bo Jensen, George W. Rogers en David A. Ferrick zijn werknemers van Seahorse Bioscience, die reagentia en instrumenten die in dit artikel wordt veroorzaakt.

Deze test is afgeleid van de klassieke experiment om mitochondriale functie sonde en dient als een raamwerk waarmee meer complexe experimenten gericht op het begrijpen diverse veranderingen in het celmetabolisme, de mitochondriale functie, en de algehele bio-energetica te bouwen. Alle verbindingen die in dit experiment moet worden geoptimaliseerd voor de concentratie die het maximale effect geeft. Dat wil zeggen, men moet apart titratie-experimenten uit te voeren om deze waarden vast te stellen. Dit is vooral belangrijk met FCCP, zoals de titratiecurve de neiging om heel scherp, en te veel FCCP daadwerkelijk kan de reacties verminderen in OCR. Typische reeksen (eindconcentraties) om te testen zou zijn: <ul><li> 0,1 tot 1,0 ug / ml Oligomycin </li><li> 0,1 tot 5,0 uM FCCP </li><li> 0,1 tot 1,0 uM Rotenon </li></ul> Merk op dat de antwoorden op elke verbinding hierboven (in het bijzonder FCCP) zal worden beïnvloed door de test media samenstelling (basistype, [glucose], [pyruvaat], de aanwezigheid / afwezigheid van BSA, enz.). Verder, als de XF test media samenstelling is veranderd, zal optimalisatie moeten opnieuw worden uitgevoerd. De aanwezigheid en concentratie van pyruvaat is vooral van belang bij het verkrijgen van de maximale respiratoire capaciteit als gevolg van FCCP. Zeepaardje Bioscience heeft waargenomen in een aantal cellen lijnen die omissie van pyruvaat het vermogen van cellen om maximaal te reageren (zie boven baseline) te FCCP schaft. Normaal gesproken, moet de concentratie van 1-10 mM pyruvaat worden getest om de optimale concentratie van pyruvaat te begrijpen maximale ademhaling te verkrijgen. Merk op dat [pyruvaat] EN [glucose] moet mogelijk worden "cross-getitreerd" om de optimale media voorwaarden voor het experiment te verkrijgen. Typische resultaten van dit experiment worden hieronder weergegeven in een grafiek met OCR versus tijd en een ander laten zien ECAR vs tijd: <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. OCR vs Time <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. ECAR vs Time Hier hebben we de verwachte responsen waargenomen in OCR en ECAR als de cellen worden behandeld met elke opeenvolgende verbinding. Voor oligomycin, OCR afneemt als gevolg van het blokkeren van ATP-synthese op mitochondriale Complex V. Sinds de cellen niet in staat om ATP te synthetiseren via OXPHOS, ze terug te keren naar glycolyse om hun vraag naar ATP te voldoen, dus zien we een toename van de ECAR. Zoals eerder aangegeven, FCCP fungeert als een ontkoppeling agent. Omdat de cellen moet nu overwinnen van de proton lek over het binnenste mitochondriale membraan, OCR aanzienlijk toeneemt naarmate er meer O2 wordt geconsumeerd om terug te pompen het overtollige protonen over het mitochondriale membraan. Tot slot, rotenon remt mitochondriaal Complex I en Complex III, respectievelijk, waardoor de stroom van elektronen te staken in de elektronen transportketen, en daarmee de consumptie van O2 is drastisch verminderd. <img src="/files/ftp_upload/2511/2511fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Ademhaling parameters Verder dan de verwachte veranderingen in ademhaling en ECAR, kan een aantal respiratoire parameters worden verkregen van deze gegevens. Dit is samengevat in de figuur hierboven: Hier zien we dat we informatie over de basale ademhaling van de cellen, het percentage van de O2-consumptie gewijd aan de ATP productie evenals het bedrag voor het handhaven van de proton gradiënt (ten gevolge van H + lekken) te verkrijgen. Verder kunnen we de maximale ademhaling te verkrijgen onder de voorwaarden van het afgekoppelde ademhaling (soms aangeduid als reserve-respiratoire capaciteit) en tot slot, kunnen we de hoeveelheid O2-verbruik niet te wijten aan mitochondriale processen bepalen. Een snel groeiend aantal studies zijn dienst dit mitochondriale profiel om cellulaire bio-energetica beoordelen, mitochondriale disfunctie te identificeren en om het vermogen van cellen om te reageren op stress en / of beledigingen voorspellen. Voor meer informatie en details over deze experimentele methode en het idee van de vrije ademhaling capaciteit, zie verwezen naar de volgende publicaties 1-8.

<table><tbody><tr><td>Oligomycine, FCCP, rotenon en antimycine A-oplossingen</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td>Seahorse Mito Stress Test Kit</td></tr><tr><td>DMEM-runmedium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>100965-000</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Gedestilleerd water</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15230-170</td><td></td></tr><tr><td>Kalibratiebuffer</td><td>Seahorse Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bio-energetische profiel experiment met behulp van c2c12 myoblast cellen

Bioenergetic Profile Experiment using C2C12 Myoblast Cells

De mogelijkheid om cellulaire stofwisseling te meten en te begrijpen mitochondriale dysfunctie, heeft het mogelijk gemaakt wetenschappers wereldwijd om hun onderzoek te bevorderen in het begrijpen van de rol van de mitochondriale functie in obesitas, diabetes, veroudering, kanker, cardiovasculaire functie en veiligheid van toxiciteit. Cellulair metabolisme is het proces van het substraat opname, zoals zuurstof, glucose, vetzuren en glutamine, en de daaropvolgende omzetting van energie door middel van een serie van enzymatisch gecontroleerde oxidatie en reductie reacties. Deze intracellulaire biochemische reacties resulteren in de productie van ATP, de vrijlating van warmte-en chemische bijproducten, zoals lactaat en CO 2 in het extracellulaire milieu. Waardevol inzicht in de fysiologische toestand van de cellen, en de wijziging van de toestand van die cellen, kan worden verkregen door middel van het meten van de snelheid van zuurstof wordt verbruikt door de cellen, een indicator van de mitochondriale ademhaling - het zuurstofverbruik Rate - of OCR. Cellen ook het genereren van ATP via glycolyse, dat wil zeggen: de omzetting van glucose naar lactaat, onafhankelijk van zuurstof. In gekweekte putten, lactaat is de primaire bron van protonen. Het meten van de melkzuur indirect geproduceerd via protonen vrijkomen in het extracellulaire medium rondom de cellen, waardoor verzuring van het medium zorgt voor de extra-cellulaire Verzuring Rate - of ECAR. In dit experiment worden C2C12 myoblast cellen gezaaid bij een bepaalde dichtheid in Seahorse celkweek platen. De basale zuurstofverbruik (OCR) en extracellulaire verzuring (ECAR) tarieven zijn gemeten met de uitgangswaarde tarieven vast te stellen. De cellen worden vervolgens metabolisch verstoord door drie toevoegingen van verschillende verbindingen (achter elkaar) dat de bio-energetische profiel van de cel shift. Deze test is afgeleid van een klassiek experiment om te beoordelen mitochondriën en fungeert als een raamwerk waarmee meer complexe experimenten gericht op het begrijpen zowel fysiologische en pathofysiologische functie van de mitochondriën te bouwen en het vermogen van cellen om te reageren op stress en / of beledigingen voorspellen.

Een beschrijving van een methode voor het profileren van mitochondriale functie in cellen wordt verzorgd. De gegenereerde mitochondriale profiel biedt vier parameters van mitochondriële functie die kan worden gemeten in een experiment: basale ademhaling, ATP-linked ademhaling, proton lek, en reservecapaciteit.

Bio-energetische Profiel Experiment met behulp van C2C12 myoblast Cellen

Het vermogen om het cellulaire metabolisme te meten en mitochondriële dysfunctie te begrijpen, heeft wetenschappers wereldwijd in staat gesteld hun onderzoek naar ... verder te brengen.

Het algemene doel van het volgende experiment is om de functionele status van mitochondriën in levende cellen en geïsoleerde mitochondriën te testen door meerdere parameters van het oxidatieve metabolisme te meten met de XF 96 extracellular flux analyzer. Deze parameters zijn de basale respiratie, ATP-omzetting, protonlek en de maximale respiratie of reserve-respiratoire capaciteit. Dit wordt bereikt door opeenvolgend specifieke modulatoren van de mitochondriale respiratie toe te voegen aan C2C12-myoblastcellen en de verandering in de zuurstofconsumptiesnelheid, of OCR, een indicator van respiratie, en de omzetting van glucose naar lactaat, waarbij ATP via glycolyse wordt gegenereerd, te meten.De andere belangrijke energiepad in cellen wordt eveneens gemeten als ECAR of extracellulaire verzuringssnelheid. Er kunnen resultaten van mitochondriale profilering worden verkregen die inzicht geven in de centrale rol die de mitochondriale functie speelt bij het bepalen van de levensduur van cellen. Hallo, mijn naam is David Nichols.Gedurende mijn gehele carrière ben ik een mitochondriale kunstenaar geweest en het belangrijkste instrument dat ik in mijn studies heb gebruikt, is de zuurstofelektrode. Wanneer u de snelheid van de zuurstofopname onder verschillende condities met geïsoleerde mitochondriën kunt meten, verkrijgt u een enorme hoeveelheid cruciale informatie. Wanneer u overstapt op cellen, met name cellen die worden gekweekt in een multi-wellplaat of op een dekglasplaatje, werken de klassieke methoden niet.Dit is een groot probleem, dat enkele jaren geleden werd opgelost door de ontwikkeling van een multi-well plaat assay, waardoor we de respiratie van cellen parallel in een multi-well plaatformaat kunnen bestuderen. Wat u vandaag zult zien is een zeer eenvoudig maar informatierijk experiment, dat we hebben ontworpen om de basisstroom van mitochondriale bioenergetische functies in gekweekte cellen te monitoren. Begin met het uitplaten van cellen in XF 96 celkweekplaten met 10.000 cellen per well in 100 µL groeimedium en plaats deze in een incubator van 37 °C met 10% CO2.De cellen kunnen worden geanalyseerd in de XF 96, 24 uur na het uitplaten met behulp van de assay. De Wizard genereert een sjabloon met de volgende groepsindeling. Kolommen één tot en met 12 bevatten elk 10.000 C two C 12-cellen.Groep één in het blauw wordt gebruikt als controlecellen. Groep twee in het rood krijgt de geneesmiddelen oligomycine, FCCP en rotenon toegediend. Bereid vervolgens de verbindingen in X-F-D-M-E-M assay-medium voor zoals beschreven in het geschreven gedeelte van het protocol.Oligomycine, FCCP, rotenon. Deze verbindingen zijn vooraf gedoseerd in de XF cell MIT stress test kit. Vervang met behulp van het XF prep station het groeimedium door DMEM runmedium.Incubeer de cellen tot slot 60 minuten in een incubator van 37 °C zonder kooldioxide, zodat de cellen vooraf kunnen equilibreren met het assay-medium. Breng de injecteerbare verbindingen voor het toevoegen aan de sensorkartridge op 37 °C. Laad ze vervolgens als volgt in de injectiepoorten. Laad voor kolommen één tot en met vier respectievelijk 16, 18 en 20 µL XF assay-medium of DMEM in poorten A, B en C.Laad voor kolommen vijf tot en met 12 16 µL oligamycine in poort A, 18 µL FCCP in poort B en 20 µL rotenon in poort C. Definieer vervolgens de protocolcommando's: stel de loop in op drie keer, het mengen op drie minuten en de meting op drie minuten. Klik daarna op start.Volg de instructies op het scherm die de gebruiker aangeven wanneer de cartridge geplaatst moet worden zodra de kalibratie is voltooid. Volg de aanwijzingen en plaats de celplaat voor het experiment. Klik vervolgens op doorgaan en laat de assay verlopen.Verwijder de plaat wanneer het experiment is beëindigd. Deze assay is afgeleid van het klassieke experiment om de mitochondriale functie te profileren en dient als een raamwerk om complexere experimenten op te zetten die gericht zijn op het begrijpen van de effecten van verschillende verbindingen op het celmetabolisme, de mitochondriale functie en de algemene bio-energetische activiteiten. Hier observeerden we de verwachte respons in de zuurstofconsumptiesnelheid terwijl de cellen werden behandeld met elke opeenvolgende verbinding.Voor ligamycine nam de OAR af als gevolg van het blokkeren van de ATP-synthese bij mitochondriaal complex vijf. Omdat de cellen na een ligamycine-behandeling niet in staat waren om ATP te synthetiseren via oxidatieve fosforylering, schakelden ze over op glycolyse om aan hun behoefte aan ATP te voldoen. Hierdoor observeerden we een toename in ECAR, de extracellulaire verzuringssnelheid, een indicator voor glycolyse zoals eerder aangetoond. FCCP werkt als een ontkoppelingsmiddel en heft de beperking van de protonenterugkeer op.De respiratie versnelt en wordt nu beperkt door het elektronentransport. Tot slot remt rotenon het mitochondriale complex I, waardoor de elektronenstroom in de elektronentransportketen stopt en het zuurstofverbruik drastisch wordt verminderd. Hierbij wordt informatie verkregen over de basale respiratie van de cellen, het percentage zuurstofverbruik dat wordt besteed aan de ATP-productie, evenals de hoeveelheid die wordt besteed aan het in stand houden van de protongradiënt als gevolg van protonlekkage.Bovendien kunnen we de maximale ademhalingssnelheid bepalen onder omstandigheden van ontkoppelde respiratie, wat soms wordt aangeduid als de reserve-respiratoire capaciteit. En tot slot kunnen we de hoeveelheid zuurstofverbruik bepalen die niet het gevolg is van mitochondriale processen. Dit heeft u zojuist gezien met de Seahorse.XF 96 is een reeks experimenten die een enorme hoeveelheid informatie verschaft over de bioenergetica van de mitochondriën in de cel. Het basisexperiment, dat van groot belang is en dat we experiment nummer één noemen, geeft informatie over de basale respiratie, de ATP-omzetting, het mitochondriale protonlek en de reserve-respiratoire capaciteit. Deze parameters leveren deze fundamentele informatie over de bioenergetische status van de mitochondriën in de cel.

bioenergetic-profile-experiment-using-c2c12-myoblast-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een niet-invasieve middelen voor het succes van transplantatie myoblast evalueren beschreven. De methode maakt gebruik van een verenigd fusie reportergen samengesteld uit genen waarvan de expressie kan worden afgebeeld met verschillende beeldvormende technieken. Hier maken we gebruik van...

Molecular Imaging te Getransplanteerde Muscle Progenitor Cellen Target

Glycolyse is een bepalende metabolische marker in meerdere biologische systemen. Het monitoren van glycolyse door het meten van de extracellulaire flux van H+ is gebruikelijk, maar vereist correctie om kwantitatief en eenduidig te zijn. Hier laten we zien hoe je extracellulaire fluxgegevens kunt verzamelen en corrigeren om onderscheid te maken tussen respiratoire en glycolytische bronnen van extracellulaire acidificatie.

Meting en analyse van de extracellulaire zuurproductie te bepalen glycolytisch Rate

In dit protocol presenteren we de procedures vaststelling myotone dystrofie 1 myoblast modellen, waaronder geoptimaliseerde C2C12 celonderhoud, gen transfectie / transductie en myocyt differentiatie.

Modelleren van myotone dystrofie 1 in C2C12 myoblastcellen

Endotheelcellen mitochondriën zijn van cruciaal belang voor de bloed-hersen-barrière integriteit te behouden. We introduceren een protocol om bio-energetische functie meten cerebrale vasculaire endotheliale cellen.

Evaluatie van de Bio-energetische Function in Cerebral vasculaire endotheelcellen

De studie van metabolisme wordt steeds relevanter voor immunologisch onderzoek. Hier presenteren we een geoptimaliseerde methode voor het meten van glycolyse en mitochondriale ademhaling in muis splenocyten, en T- en B-lymfocyten.

Een geoptimaliseerde Protocol Analyseer glycolyse en mitochondriale Ademhaling in lymfocyten

Het doel van dit protocol is spectrophotometrically trans-plasma membraan elektronentransport met behulp van extracellulaire elektronen acceptoren controleren en analyseren van enzymatische interacties die bij deze extracellulaire elektronen acceptoren optreden kunnen.

Meten van Trans-Plasma membraan elektronentransport door C2C12 Myotubes

We bieden een protocol om genen die extracellulaire matrix (ECM) eiwitten coderen in C2C12 myoblasten neer te halen met behulp van small-hairpin (sh) RNA. Gericht op ADAMTSL2 als voorbeeld, beschrijven we de methoden voor de validatie van de knockdown-efficiëntie op het mRNA-, eiwit- en cellulair niveau tijdens C2C12 myoblast tot myotubedifferentiatie.

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

Real-time cel metabole flux assay meet het zuurstofverbruik en de extracellulaire verzuringssnelheid, die overeenkomt met mitochondriale en glycolytische adenosinetrifosfaatproductie, met behulp van pH- en zuurstofsensoren. Het manuscript legt een methode uit om de energiestatus van osteoblasten en de karakterisering en interpretatie van de cellulaire bio-energetische status te begrijpen.

Real-time cell metabolic flux analyzer gebruiken om osteoblast bio-energetica te monitoren

De metabole status van menselijke retinale pigmentepitheelcellen (H-RPE) weerspiegelt hun gezondheid en functie. Hier wordt een geoptimaliseerd protocol gepresenteerd voor het onderzoeken van de real-time metabole flux van H-RPE met behulp van respirometrie met hoge resolutie.

Real-time analyse van bio-energetica in primaire menselijke retinale pigmentepitheelcellen met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Geïsoleerde perifere mononucleaire bloedcellen kunnen worden gebruikt voor de analyse van immuunfuncties en -aandoeningen, stofwisselingsziekten of mitochondriale functies. In dit werk beschrijven we een gestandaardiseerde methode voor de bereiding van PBMC's uit volbloed en de daaropvolgende cryopreservatie. Cryopreservatie maakt deze tijd en plaats onafhankelijk.

Cryopreservatie en bio-energetische evaluatie van mononucleaire cellen in menselijk perifeer bloed

Leer bio-energetisch profielonderzoek met C2C12-myoblastcellen met de XF 96-analyzer. Deze methode meet mitochondriale ademhaling, ATP-koppeling en protonlek voor inzicht in cellulaire metabolisme.

Bio-energetische Profiel Experiment met behulp van C2C12 myoblast Cellen

Meer video's verkennen