Name: Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Ontdek een analytische toolbox voor biofilmonderzoek met confocale fluorescentiebeeldvorming en aangepaste software. Deze methode maakt gedetailleerde structurele en transcriptoomanalyses van orale biofilms mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen dr. Gary Xie en Herbert Lee bedanken voor de ontwikkeling van de MDV. We danken ook Drs. Simone Duarte, Ramiro Murata, Jae-Gyu Jeon, Jacqueline Abranches, en mevrouw Stacy Gregoire van hun technische en wetenschappelijke bijdrage voor de analytische componenten van de tool-box. Dit onderzoek werd mede ondersteund door USPHS Research verlenen DE018023 van het National Institute of Dental en Craniofaciale Research.

<ol><li>Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+biofilms%3A+a+common+cause+of+persistent+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+the+matrix+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li>
<li>Leme, P. aes, Koo, A. F., Bellato, H., Bedi, C. M., G, J. A. C. ury <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+sucrose+in+cariogenic+dental+biofilm+formation--new+insight%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">The role of sucrose in cariogenic dental biofilm formation--new insight.</a> J Dent Res. 85, 878-887 (2006).</li>
<li>Koo, H., Schobel, B. D., Scott-Annem, K., Watson, G., Bowen, W. H., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apigenin+and+tt-farnesol+with+fluoride+effects+on+S.+mutans+biofilms+and+dental+caries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dent+Res%22%5BJournal%5D)">Apigenin and tt-farnesol with fluoride effects on S. mutans biofilms and dental caries.</a> J Dent Res. 84, 1016-1020 (2005).</li>
<li>Koo, H., Xiao, J., Klein, M. I., Jeon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exopolysaccharides+produced+by+Streptococcus+mutans+glucosyltransferases+modulate+the+establishment+of+microcolonies+within+multispecies+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Exopolysaccharides produced by Streptococcus mutans glucosyltransferases modulate the establishment of microcolonies within multispecies biofilms.</a> J Bacteriol. 192, 3024-3032 (2010).</li>
<li>Jeon, J. G., Klein, M. I., Xiao, J., Gregoire, S., Rosalen, P. L., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influences+of+naturally+occurring+agents+in+combination+with+fluoride+on+gene+expression+and+structural+organization+of+Streptococcus+mutans+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influences of naturally occurring agents in combination with fluoride on gene expression and structural organization of Streptococcus mutans in biofilms.</a> BMC Microbiol. 9, 228-228 (2009).</li>
<li>Klein, M. I., DeBaz, L., Agidi, S., Lee, H., Xie, G., Lin, A. H. M., Hamaker, B. R., Lemos, J. A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Streptococcus+mutans+transcriptome+in+response+to+starch+and+sucrose+during+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Streptococcus mutans transcriptome in response to starch and sucrose during biofilm development.</a> PLoS ONE. , 0013478-0013478 (2010).</li>
<li>Lemos, J. A., Abranches, J., Koo, H., Marquis, R. E., Burne, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+to+Study+the+Physiology+of+Oral+Biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Protocols to Study the Physiology of Oral Biofilms.</a> Methods Mol Biol. 666, 87-102 (2010).</li>
<li>Koo, H., Hayacibara, M. F., Schobel, B. D., Cury, J. A., Rosalen, P. L., Park, Y. K., Vacca-Smith, A. M., Bowen, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Streptococcus+mutans+biofilm+accumulation+and+polysaccharide+production+by+apigenin+and+tt-farnesol%5BTitle%5D)+AND+%22J+Antimicrob+Chemother%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Streptococcus mutans biofilm accumulation and polysaccharide production by apigenin and tt-farnesol.</a> J Antimicrob Chemother. 52, 782-789 (2003).</li>
<li>Koo, H., Seils, J., Abranches, J., Burne, R. A., Bowen, W. H., Quivey, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+apigenin+on+gtf+gene+expression+in+Streptococcus+mutans+UA159%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Influence of apigenin on gtf gene expression in Streptococcus mutans UA159.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 50, 542-546 (2006).</li>
<li>Klein, M. I., Duarte, S., Xiao, J., Mitra, S., Foster, T. H., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+molecular+basis+of+the+role+of+starch+and+sucrose+in+Streptococcus+mutans+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural and molecular basis of the role of starch and sucrose in Streptococcus mutans biofilm development.</a> Appl Environ Microbiol. 75, 837-841 (2009).</li>
<li>Cury, J. A., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+and+purification+of+total+RNA+from+Streptococcus+mutans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms.</a> Anal Biochem. 365, 208-214 (2007).</li>
<li>Xiao, J., Koo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+organization+and+dynamics+of+exopolysaccharide+matrix+and+microcolonies+formation+by+Streptococcus+mutans+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Structural organization and dynamics of exopolysaccharide matrix and microcolonies formation by Streptococcus mutans in biofilms.</a> J Appl Microbiol. 108, 2103-2113 (2010).</li>
<li>Thurnheer, T., Gmür, R., Shapiro, S., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+transport+of+macromolecules+within+an+in+vitro+model+of+supragingival+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mass transport of macromolecules within an in vitro model of supragingival plaque.</a> Appl Environ Microbiol. 69, 1702-1709 (2003).</li>
<li>Chalmers, N. I., Palmer, R. J. J. r, Du-Thumm, L., Sullivan, R., Shi, W., Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+quantum+dot+luminescent+probes+to+achieve+single-cell+resolution+of+human+oral+bacteria+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of quantum dot luminescent probes to achieve single-cell resolution of human oral bacteria in biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 73, 630-636 (2007).</li>
<li>Deng, D. M., Hoogenkamp, M. A., Ten Cate, J. M. >, Crielaard, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+metabolic+activity+indicator+in+Streptococcus+mutans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Novel metabolic activity indicator in Streptococcus mutans biofilms.</a> J Microbiol Methods. 77, 67-71 (2009).</li>
</ol>

In deze presentatie hebben we aangetoond dat twee cruciale onderdelen van de Analytische Tool-Box (EPS / bacteriën imaging en microarray data mining / verwerking), de veelzijdigheid en het nut van de verschillende testen geïntegreerd in het systeem. Het is duidelijk dat de tool-box vergemakkelijkt de uitgebreide (vergelijkende) en gelijktijdige analyse van de verschillende aspecten van de biofilms biochemie, architectuur en genexpressie in reactie op de verschillende experimentele condities met behulp van een in vit...

<table><tbody><tr><td>Syto 9</td><td>Invitrogen</td><td>S34854</td><td></td></tr><tr><td>Syto 60</td><td>Invitrogen</td><td>S11342</td><td></td></tr><tr><td>Dextran geconjugeerd alexa 647</td><td>Invitrogen</td><td>D22914</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV1000 twee-foton laser scanning microscoop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

een analytisch instrument-box voor de uitgebreide biochemische, structurele en transcriptome evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen

An Analytical Tool-box for Comprehensive Biochemical, Structural and Transcriptome Evaluation of Oral Biofilms Mediated by Mutans Streptococci

Biofilms zijn zeer dynamisch, georganiseerd en gestructureerd gemeenschappen van microbiële cellen verstrikt in een extracellulaire matrix van de variabele dichtheid en samenstelling 1, 2. In het algemeen, biofilms ontwikkelen van de eerste microbiële beslag op een oppervlak gevolgd door de vorming van cel-clusters (of microkolonies) en de verdere ontwikkeling en stabilisatie van de microkolonies, die voorkomen in een complexe extracellulaire matrix. De meerderheid van de biofilm matrices haven exopolysacchariden (EPS), en tandheelkundige biofilms vormen hierop geen uitzondering, vooral die in verband met cariës ziekte, die meestal gemedieerd door mutans streptococcen 3. De EPS worden gesynthetiseerd door micro-organismen (S. mutans, een belangrijke bijdrage levert) door middel van extracellulaire enzymen, zoals glucosyltransferases gebruik van sucrose in de eerste plaats als substraat 3. Studies van biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn bijzonder uitdagend vanwege hun constante blootstelling aan milieu-uitdagingen in verband met complexe dieet-host-microbiële interacties die voorkomen in de mondholte. Beter begrip van de dynamische veranderingen van de structurele organisatie en de samenstelling van de matrix, fysiologie en transcriptoom / proteoom profiel van biofilm-cellen in reactie op deze complexe interacties verder zou vooraf de huidige kennis van hoe orale biofilms moduleren pathogeniteit. Daarom hebben we een analyse-tool-box om biofilm analyse te vergemakkelijken op structureel, biochemisch en moleculair niveau door een combinatie van algemeen beschikbare en nieuwe technieken met op maat gemaakte software voor data-analyse. Standaard analytische (colorimetrische assays, RT-qPCR en microarrays) en nieuwe fluorescentie technieken (voor simultane etikettering van bacteriën en EPS) werden geïntegreerd met specifieke software voor data-analyse van de complexe aard van de orale biofilm onderzoek adres. De tool-box bestaat uit 4 verschillende, maar onderling verbonden stappen (figuur 1): 1) Bioassays, 2) Raw Data-ingang, 3) Data Processing, en 4) data-analyse. We gebruikten onze in vitro biofilm-model en de specifieke experimentele omstandigheden op het nut en de flexibiliteit van de tool-box aan te tonen. De biofilm-model is eenvoudig, reproduceerbare en meerdere herhalingen van een enkel experiment kunnen gelijktijdig 4 worden gedaan, 5. Bovendien, is het mogelijk tijdelijk de evaluatie, de opname van verschillende micro-organismen 5 en beoordeling van de effecten van de verschillende experimentele condities (bijvoorbeeld behandelingen 6; vergelijking van de knock-out mutanten vs ouderlijke stam 5; koolhydraten beschikbaarheid 7). We beschrijven hier twee specifieke onderdelen van de tool-box, waaronder (i) nieuwe software voor microarray data mining / organisatie (MDV) en fluorescentie beeldvorming analyse (DUOSTAT), en (ii) in situ EPS-labeling. We bieden ook een experimentele geval zien hoe de tool-box kan u helpen met biofilms analyse, data-organisatie, de integratie en interpretatie.

Biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn zeer complex en worden blootgesteld aan een constante aangeboren en exogene milieu-uitdagingen, die hun architectuur moduleren, fysiologie en transcriptoom. We ontwikkelden een toolbox om de samenstelling, de structurele organisatie en gen-expressie van orale biofilms, die kan worden aangepast aan andere gebieden van de biofilm onderzoek te onderzoeken.

Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen

Biofilms zijn zeer dynamische, georganiseerde en gestructureerde gemeenschappen van microbiële cellen, ingebed in een extracellulaire matrix van variabele dichtheid en ...

Biofilms die zich op tandoppervlakken vormen, zijn uiterst complex en gestructureerd. Het betreft microbiële gemeenschappen ingebed in een extracellulaire matrix, die voortdurend worden blootgesteld aan omgevingsfactoren. Het algemene doel hier is om twee specifieke componenten van een analytische gereedschapskist te presenteren die is ontworpen om structurele en moleculaire studies te vergemakkelijken, waarbij rekening wordt gehouden met de complexe aard van orale biofilms door een nieuwe fluorescentie-imagingtechniek te combineren met op maat gemaakte software voor gegevensverwerking en -analyse.Dit wordt bereikt door eerst specifieke assays te selecteren voor de analyse van biofilm, transcriptoom en structuur, waaronder een nieuwe confocale beeldvormingsmethode voor gelijktijdige visualisatie van EPS en bacteriën. De tweede stap van de procedure is het verzamelen van de ruwe gegevens uit de bioassays. De derde stap is het verwerken van de ruwe gegevens met specifieke software, waaronder de recent ontwikkelde duo stat voor colocalisatieanalyse.De laatste stap is het analyseren van de procesgegevens, inclusief het gebruik van software voor microarray-datamining en -organisatie, zoals de Microarray Data Visualizer of MDV. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die laten zien hoe orale pathogenen hun transcriptoom en de architectuur van de biofilms veranderen als reactie op een complex dieet en interacties met de microben van de gastheer met behulp van onze unieke geïntegreerde analytische toolkit, wat een meer uitgebreide biofilm-analyse en interpretatie van gegevens mogelijk maakt. Hallo, mijn naam is Michelle Kuh, universitair hoofddocent bij het Center for Oral Biology hier aan het University of Rochester Medical Center.Vandaag presenteren wij een analytische toolbox voor biofilm-analyse. Deze toolbox kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van biofilm-onderzoek, zoals de structuur van biofilmcellen, hun ordening ten opzichte van de extracellulaire matrix en hoe zij op transcriptoomniveau reageren op complexe omgevingsuitdagingen. Mijn naam is Jean, ik ben postdoc-onderzoeker in het laboratorium van Dr. Ks.Vandaag ga ik het beeldvormingsgedeelte van onze toolkit demonstreren. Hoi, ik ben Aise Klein. Ik ben research assistant professor in het laboratorium van Dr. Ks.Vandaag presenteer ik de MDV-software voor de analyse van microray-gegevens. In deze procedure worden met speeksel gecoate hydroxyapatiet-schijfjes gebruikt als surrogaat voor het tandoppervlak waarop biofilms worden gekweekt. Voeg eerst 2,8 milliliters kweekmedium geïnoculeerd met S mutants toe aan elke put van een 24-puts plaat; bescherm de plaat tegen licht. Voeg aan elke put dextrine-geconjugeerde LOR 6 47-kleurstof toe tot een eindconcentratie van 1 micromolar en pipetteer dit meerdere keren op en neer om de kleurstof in het kweekmedium te mengen.Dip en was vervolgens de steriele, met speeksel gecoate hydroxyapatiet-schijfjes met een steriele pincet twee keer in steriele AB-buffer om overtollig speeksel of ongebonden speekselcomponenten te verwijderen. Plaats de schijfjes daarna verticaal in het met kleurstof aangevulde kweekmedium, waarbij u ervoor zorgt dat elk schijfje volledig is ondergedompeld. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer deze 20 uur lang bij 37 °C in een incubator met 5% CO2, zodat de biofilms kunnen vormen en de geconjugeerde textuur kan worden geïncorporeerd in de exopolysachariden die door de bacteriële cellen worden geproduceerd.Om de bacteriële cellen te labelen, bereidt u eerst een 24-wells plaat voor met 2,8 milliliters steriel milli Q-water per well. Voeg 1,5 microliters cyto nine-kleurstof toe aan elke well tot een eindconcentratie van één micromolar en bescherm de plaat tegen licht. Zodra de biofilm is gevormd, haalt u de plaat met de schijfjes uit de incubator.Was elke schijf in een oplossing van 0,89% natriumchloride. Breng ze vervolgens over naar de nieuwe plaat met de cyto nine-kleurstof. Dek de plaat af met aluminiumfolie en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Zodra de cellen zijn gekleurd, worden de biofilms ondergedompeld en gewassen in natriumchloride zoals voorheen. Laat vervolgens de biofilms met een pincet van het draad in een Petrischaal met natriumchloride glijden. Wikkel de Petrischaal in aluminiumfolie.De biofilmen zijn nu klaar voor visualisatie via confocale microscopie met behulp van een laser-scanning confocale microscoop. Scan elke biofilm op vijf tot 10 willekeurig gekozen posities en genereer op elke positie een Z-serie. Open de confocale beelden en verwerk deze met een mirror-software om 3D-reconstructies mogelijk te maken.Deze driedimensionale weergave van confocale beelden, geproduceerd met het programma Amira, toont een biofilm van S-mutanten die is gevormd op het apathische oppervlak met behulp van de gedemonstreerde procedure. Bacteriële cellen en microkolonies zijn zichtbaar in het groen en zijn ingebed in de biofilmmatrix die exopolysachariden bevat. In het rood kan een detailweergave van een geselecteerd gebied worden gegenereerd, waarin de specifieke structurele relatie tussen de bacteriën en de EPS op microschaal wordt geïllustreerd.Gebruik het duos stat-programma om de mate van colokalisatie van afzonderlijke biofilmcomponenten, zoals de bacteriën en de exopolysachariden, te kwantificeren. Stel eerst het pad van de nieuw ontwikkelde duo stat in MATLAB versie 5.1 in en open de afbeeldingsmappen met de Z-serie beelden van de twee biofilmcomponenten. Kies vervolgens de twee kanalen die gecorreleerd en geanalyseerd zullen worden.De twee beeldstacks moeten identieke pixelafmetingen hebben in alle dimensies en hetzelfde aantal beelden per stack bevatten. Stel de drempelwaarden voor elk kanaal in, volg de instructies in de software-interface en voer de gegevens in het gegevensverwerkingsbestand in voor analyse. Deze figuur laat zien hoe duo stack de ruimtelijke relatie tussen bacteriën en DBS kwantitatief interpreteert.Binnen de biofilm berekent Duo stack de verticale distributie van bacteriën en DPS van het schijfoppervlak tot de vloeistoffase, zoals hier te zien is aan de groene lijn voor bacteriën en de rode lijn voor EPS. Het berekent ook de colocalisatie van bacteriën en DPS over de dikte van de biofilm. Zoals getoond in de gele lijn, vertonen de gegevens hogere proporties EPS dan bacteriën over de biofilmdiepte, en de meeste bacteriële cellen zijn geassocieerd met EPS, vooral vanaf de middelste lagen en hoger. Duo stat met 3D-rendering biedt een verbeterd begrip van de structurele organisatie en interactie van bacteriën en DPS in biofilms.Om ervoor te zorgen dat er RNA van hoge kwaliteit uit biofilms wordt verkregen, raden wij aan om de RNA-extractie uit te voeren volgens het biofilmspecifieke protocol dat is beschreven in het artikel van Curian KU, gepubliceerd in 2007. In het tijdschrift Analytical Biochemistry worden standaardprotocollen gebruikt voor de preparatie van cDNA-microarrays en kwantitatieve realtime PCR-assays. Om de analyse van de grote datasets die door microarray-experimenten worden gegenereerd te vergemakkelijken, hebben we software voor datamining en organisatie ontworpen, de microarray data visualizer of MDV, die online beschikbaar is via www.oralgen.anl.gov.Voordat de gegevens naar MDV worden verzonden, dient een statistische analyse te worden uitgevoerd, zoals een gepaarde T-test met een random variance-model, met behulp van de online beschikbare BRB array tool-software, waarbij een afkapwaarde (P-waarde) van 0,001 wordt gehanteerd voor de klassenvergelijking. In dit voorbeeld is een analyse uitgevoerd op s mutton's, biofilms gekweekt in drie verschillende sugerconcentraties en op vier tijdstippen. Er werden gepaarde vergelijkingen uitgevoerd die resulteerden in drie BRB-bestanden: conditie A 0,5% sucrose plus 1% zetmeel versus 1% sucrose, conditie B 0,5% sucrose plus 1% zetmeel versus 0,5% sucrose en conditie C 0,5% sucrose versus 1% sucrose.Dit paneel geeft het aantal genen weer dat als differentieel tot expressie gebracht is gedetecteerd in elke conditie en op elk tijdstip, geëvalueerd via standaard klassevergelijking met de BRB array tool, wat resulteert in een groot aantal genen aangeduid als BRB ruwe data. Voor de demonstratie van MDV zullen we ons met behulp van Excel richten op tijdstip 30 uur. Converteer de BRB ruwe data naar MDV tab-begrensde tekstbestanden.Zorg ervoor dat alle letters die bij het nummer van het genlocus-tabblad horen worden verwijderd, bijvoorbeeld in de naam SMU dot 1432 C. Verwijder de letter C en open MDV. Open het bestandmenu en kies voor het selecteren van de annotatiebron. Selecteer de optie flat file wanneer er een dialoogvenster verschijnt.Gebruik de browse-knoppen om de bestanden te selecteren die annotaties bevatten voor gene ontology-nummer, pathway-functionele classificatiedata en gennaam. Ga naar 'file' en importeer elk van de bestanden die zijn geconverteerd naar het MDV-formaat. Elk bestand vertegenwoordigt een experimentele conditie.Vergelijk de genen die tot expressie komen in elke experimentele conditie A versus B versus C. In dit voorbeeld gebruiken we de functie van het Venn-diagram. Voor deze demonstratie richten we ons op differentieel tot expressie gekomen genen die uniek gerelateerd zijn aan de invloeden van sucrose en zetmeel in combinatie. De functie op basis van het Venn-diagram wordt gebruikt om het aantal unieke en gedeelde genen te visualiseren die onder deze verschillende condities tot expressie komen, en helpt ons bij het identificeren van de genen die geselecteerd moeten worden voor verdere analyse.Hier selecteren we alleen de differentieel tot expressie gebrachte genen die uniek zijn in conditie A en/of B, maar niet die welke in C zijn gedetecteerd, zoals hier in het grijs wordt weergegeven. MDV heeft het totale aantal te analyseren genen aanzienlijk verminderd en tegelijkertijd de niet-relevante genen voor de experimentele casus gefilterd. Kies via het bestandmenu de exportoptie om de gegevens op te slaan.Als tab-gescheiden bestanden kunnen de bestanden vervolgens worden geopend in Excel, waar de data-output kan worden georganiseerd en kan worden omgezet in de gewenste grafische weergaven. De dataorganisatie in Excel maakt de grafische weergave van de MDV-output mogelijk. Deze grafiek geeft een overzicht van de differentiële expressie van unieke functionele subsets van genen die worden beïnvloed door de combinatie van zetmeel en sucrose in verschillende stadia van biofilmontwikkeling.De invloeden op het transcriptoom van de S-mutanten zijn na 30 uur van biofilmvorming uitgesprokener dan op andere tijdstippen. De resultaten hielpen ons om precies specifieke functionele subsets van genen te identificeren die relevant zijn voor onze werkhypothese, waarbij de temporele effecten de genselectie en het verdere validatieproces hebben gefaciliteerd. Na deze procedure kunnen ook biochemische en proteomische methoden worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat de specifieke fysiologische en metabole responsen van de organismen binnen biofilmen zijn.Een dergelijke uitgebreide en geïntegreerde analyse zou zeker helpen om beter te begrijpen hoe biofilms de pathogeniteit in de mondholte moduleren, een zeer dynamische en complexe omgeving. Raadpleeg voor meer details het PDF-bestand dat bij dit video-artikel is gevoegd.

an-analytical-tool-box-for-comprehensive-biochemical-structural

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We presenteren een protocol voor structurele en analyse van de samenstelling van natuurlijke orale biofilm van orthodontische apparatuur...

Orale Biofilm Analyse van de Palatal Expanders door middel van fluorescentie in-situ hybridisatie en confocale laser scanning microscopie

Source: Schlafer, S, and Frost Kristensen, M. Monitoring Extracellular pH in Cross-Kingdom Biofilms using Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the cultivation of Streptococcus mutans and Candida albicans cross-kingdom biofilms under oral-like conditions to model bacterial–fungal interactions, enabling the study of microbial synergy, glucan-mediated adhesion, and acidogenic virulence in oral pathogenesis.

Establishing Bacterial–Fungal Cross-Kingdom Biofilms for Studying Oral Pathogenesis

Source: Alshehri, M. et. al., Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates a co-culture model using multi-species oral biofilms and human oral epithelium. It highlights epithelial immune activation and enables the downstream analysis of host-pathogen interaction.

A Transwell Tissue Model for Studying Interactions Between Human Oral Biofilms and Epithelium

Een protocol voor de gelijktijdige kwantificering en vergelijking van drie cellulaire en extracellulaire componenten binnen biofilms wordt gepresenteerd. De methodologie omvat het gebruik van confocale laserscanningmicroscopie, software voor biofilmstructuuranalyse en -visualisatie, en statistische analysesoftware.

Concurrent Kwantificering van Cellulaire en extracellulaire componenten van biofilms

Het doel van deze methoden papier is het gebruik van een microfluïdische systeem te beschrijven voor de ontwikkeling van multi-species biofilms dat soort gewoonlijk geïdentificeerd in humaan supragingivale tandplaque bevatten. Methoden om biofilm architectuur, biofilm levensvatbaarheid, en een aanpak om te oogsten biofilm voor cultuur-afhankelijke of cultuur-onafhankelijke analyses zijn gemarkeerd beschrijven.

Toepassing van een High-throughput<em&gt; In Vitro</em&gt; Microfluïdische System op mondelinge Multi-species biofilms Ontwikkel

Biofilm-infecties vertonen een hoge tolerantie voor chemotherapie. Geen enkele test legt de complexiteit van biofilms vast. In plaats daarvan zijn aanvullende tests nodig. We presenteren een screeningsplatform (ontwikkeld voor S. aureus) dat assays voor levensvatbaarheid, biomassa en biofilmmatrix combineert. Het maakt ontdekking van anti-biofilm medicijnen mogelijk, inclusief de beoordeling van langdurige chemotherapeutische effecten.

Een platform van de Anti-biofilm Testen geschikt voor de exploratie van natuurlijke verbinding Bibliotheken

Veranderingen in de mondelinge microbiome tijdens jeugd zijn van toenemende belangstelling. Vergelijking van verschillende microbiome studies blijkt een gebrek aan gestandaardiseerde bemonstering protocollen. Beperkte ruimte maakt het geluid subgingivale Sulcus (hersenanatomie) van kinderen uitdagende bemonstering. Papieren punt bemonstering wordt hier in detail gepresenteerd als de methode van keuze voor dit gebied.

Mondelinge Biofilm bemonstering voor analyse van de Microbiome bij gezonde kinderen

Hier presenteren we een protocol om te evalueren van mondelinge biofilm vorming op titanium en zirconia materialen voor tandheelkundige prothese abutments, met inbegrip van de analyse van de levensvatbaarheid van de bacteriële cellen en morfologische kenmerken. Een in situ -model die samenhangen met krachtige microscopie technieken wordt gebruikt voor de analyse orale biofilm.

Mondelinge Biofilm vorming op verschillende materialen voor tandheelkundige implantaten

Natuurlijke producten vormen veelbelovende uitgangspunten voor de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en therapeutische middelen. Vanwege de grote chemische diversiteit is het vinden van nieuwe therapeutische verbindingen van planten echter een uitdagende en tijdrovende taak. We beschrijven een vereenvoudigde aanpak om antimicrobiële en antibiofilmmoleculen te identificeren uit plantenextracten en fracties.

Systematische aanpak om nieuwe antimicrobiële en antibiofilmmoleculen uit plantenextracten en -fracties te identificeren om tandheelkundige cariës te voorkomen

Dit protocol levert een modulaire BSL-2 workflow die kristal-violet biomassa-assays, time-lapse fase-contrast kinetiek, confocale 3D/matrix mapping, SEM-ultrastructuur en een in vivo hamsterinfectiemodule combineert om de functionele rol van Leptospira biofilm te cultiveren, kwantificeren, karakteriseren en onderzoeken, waardoor gestandaardiseerde evaluatie van mutanten en anti-biofilminterventies in laboratoria mogelijk is.

Een modulaire workflow voor kwantitatieve, structurele en functionele analyse van leptospira-biofilms

Ontdek een analytische toolbox voor biofilmonderzoek met confocale fluorescentiebeeldvorming en aangepaste software. Deze methode maakt gedetailleerde structurele en transcriptoomanalyses van orale biofilms mogelijk.

Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen (Video) | JoVE Journal

Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen

Meer video's verkennen