Een analytisch instrument-box voor de Uitgebreide Biochemische, structurele en Transcriptome Evaluatie van orale biofilms gemedieerd door mutans streptococcen
25 januari 2011
Biofilms gevormd op tandoppervlakken zijn zeer complex en worden blootgesteld aan een constante aangeboren en exogene milieu-uitdagingen, die hun architectuur moduleren, fysiologie en transcriptoom. We ontwikkelden een toolbox om de samenstelling, de structurele organisatie en gen-expressie van orale biofilms, die kan worden aangepast aan andere gebieden van de biofilm onderzoek te onderzoeken.
Biofilms die zich op tandoppervlakken vormen, zijn zeer complex en gestructureerd. Microbiële gemeenschappen verstrengeld in een extracellulaire matrix, die worden blootgesteld aan constante omgevingsuitdagingen. Het algemene doel hier is om twee specifieke componenten van een analytisch hulpmiddel te laten zien dat is ontworpen om structurele en moleculaire studies te vergemakkelijken, rekening houdend met de complexe aard van orale biofilms door een nieuwe fluorescentiebeeldvormingstechniek te combineren met op maat gemaakte software voor gegevensverwerking en -analyse.
Dit wordt bereikt door eerst specifieke assays te selecteren voor biofilm-, transcriptoom- en structuuranalyse, inclusief een nieuwe confocale beeldvormingsaanpak voor gelijktijdige visualisatie van EPS en bacteriën. De tweede stap van de procedure is het verzamelen van de ruwe gegevens uit de bioassays. De derde stap is het verwerken van de ruwe gegevens met specifieke software, inclusief de nieuw ontwikkelde duo stat voor colocalisatie-analyse.
De laatste stap is het analyseren van de procesgegevens, inclusief het gebruik van microarray data mining en organisatiesoftware microarray, data visualizer of MDV. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die laten zien hoe orale pathogenen hun transcriptoom en de architectuur van de biofilms veranderen als reactie op een complex dieet, microbiële interacties van de gastheer met behulp van onze uniek geïntegreerde analytische toolbox, die een meer uitgebreide biofilmanalyse en gegevensinterpretatie biedt. Hallo, mijn naam is Michelle Kuh, een universitair docent in het centrum, Foral biologie hier bij Universal of Rochester Medical Center.
Vandaag presenteren we een analytische toolbox voor biofilmanalyse. Deze toolbox kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van biofilmonderzoek, zoals hoe de biofilmcellen zijn gestructureerd, gerangschikt met extracellulaire matrix en hoe ze reageren op complexe omgevingsuitdagingen op transcriptoomniveau. Mijn naam is Jean, ik ben een postdoc-fellow in het lab van Dr. Ks.
Vandaag ga ik het beeldvormingsgedeelte van onze toolbox demonstreren. Hallo, ik ben Aise Klein. Ik ben onderzoeksassistent-professor bij het lab van Dr. Ks.
Vandaag zal ik de MDV-software voor microarray-gegevensanalyse presenteren. In deze procedure worden met speeksel beklede hydroxyapaat-schijven gebruikt als surrogaat voor tandoppervlakken waarop biofilms worden gekweekt. Voeg eerst 2,8 milliliter kweekmedium geïnoculeerd met S-mutanten toe in elk putje van een 24-putjesplaat en bescherm de plaat tegen licht bij dextrine-geconjugeerd LOR 6 47-kleurstof tot een eindconcentratie van één micromolar en pipetteer meerdere keren op en neer om de kleurstof in het kweekmedium te mengen.
Gebruik vervolgens steriele pincetten om de steriele met speeksel beklede hydroxyapatietschijven twee keer in steriele AB-buffer te dopen om eventueel overtollig speeksel of ongebonden speekselcomponenten te verwijderen. Plaats vervolgens de schijven verticaal in het met kleurstof aangevulde kweekmedium, zorg ervoor dat elke schijf volledig ondergedompeld is. Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer deze 20 uur bij 37 graden Celsius in een 5% koolstofdioxide-incubator om de biofilms te laten vormen en de geconjugeerde textuur te laten integreren in de exopolysacchariden geproduceerd door de bacteriële cellen.
Om de bacteriële cellen eerst te labelen, bereid een 24-putjesplaat voor met 2,8 milliliter steriele milli Q-water per putje. Voeg 1,5 microliter cyto ne-kleurstof toe aan elk putje tot een eindconcentratie van één micromolar en bescherm de plaat tegen licht. Zodra de biofilm is gevormd, verwijder de plaat met de schijven uit de incubatiedip.
Was elke schijf in een oplossing van 0,89% natriumchloride. Breng ze vervolgens over naar de nieuwe plaat met cyto ne-kleurstof. Bedek de plaat met aluminiumfolie en incubeer deze 30 minuten bij kamertemperatuur.
Zodra de cellen zijn gekleurd, was de biofilms en het natriumchloride zoals eerder. Gebruik vervolgens pincetten om de biofilms van de draad los te maken in een petrischaal met natriumchloride. Wikkel de petrischaal af met aluminiumfolie.
De biofilms zijn nu klaar voor visualisatie door middel van confocale microscopie met behulp van een laser-scanning confocale microscoop. Scan elk biofilm op vijf tot 10 willekeurig geselecteerde posities en genereer Z-reeksen op elke positie. Om 3D-reconstructies mogelijk te maken, open de confocale beelden en verwerk ze met behulp van een spiegelsoftware.
Deze driedimensionale weergave van confocale beelden geproduceerd met behulp van het programma, Amira, toont een S-mutantenbiofilm gevormd op het apathische oppervlak volgens de gedemonstreerde procedure. Bacteriële cellen en microkolonies zijn zichtbaar in groen en zijn ingebed in de biofilmmatrix die exopolysacchariden bevat. In rood kan een close-up weergave van een geselecteerd gebied worden gegenereerd, wat de specifieke bacteriële EPS-structurele relatie op microschaal illustreert.
Gebruik het duos stat-programma om de hoeveelheid colocalisering van afzonderlijke biofilmcomponenten zoals de bacteriën en de exopolysacchariden te kwantificeren. Stel eerst het pad van de nieuw ontwikkelde duo stat in MATLAB versie 5.1 in en open de beeldmappen met de Z-reeksenbeelden van de twee biofilmcomponenten. Kies vervolgens twee kanalen die gecorreleerd en geanalyseerd zullen worden.
De twee beeldastacks moeten in alle dimensies identieke pixelgrootten hebben en hetzelfde aantal afbeeldingen in elke stack. Stel de drempels voor elk kanaal in en volg de instructies in de software-interface en voer de gegevens in in het gegevensverwerkingsbestand voor analyse. Deze figuur laat zien hoe duo stack de ruimtelijke relatie tussen bacteriën en DBS kwantitatief interpreteert.
Binnen de biofilm berekent Duo stack de verticale verdeling van bacteriën en DPS van het schijfoppervlak tot vloeibare fase zoals hier te zien in de groene lijn voor bacteriën en de rode lijn voor EPS. Het berekent ook de colocalisering van bacteriën en DPS door de biofilmdikte heen. Zoals in de gele lijn getoond, laten de gegevens hogere verhoudingen van EPS dan bacteriën over de diepte van de biofilm zien
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie richt zich op de complexe aard van biofilms die zich op tandoppervlakken vormen, waarbij de nadruk wordt gelegd op hun structurele organisatie en genexpressie. Er wordt een nieuw analytisch gereedschap geïntroduceerd om de onderzoek van orale biofilms te vergemakkelijken door middel van geavanceerde beeldvormingstechnieken en gegevensverwerkingssoftware.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Microbiële ecologie
- Biofilmonderzoek
- Orale gezondheid
Achtergrond
- Biofilms zijn complexe microbiële gemeenschappen.
- Ze zijn verstrengeld in een extracellulaire matrix.
- Biofilms worden constant geconfronteerd met omgevingsuitdagingen.
- Het begrijpen van hun architectuur en fysiologie is cruciaal voor de orale gezondheid.
Doel van het onderzoek
- Om een gereedschap te ontwikkelen voor het analyseren van orale biofilms.
- Om fluorescentiebeeldvorming te combineren met aangepaste software voor gegevensanalyse.
- Om structurele en moleculaire studies van biofilms te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Selectie van specifieke assays voor biofilmanalyse.
- Nieuwe confocale beeldvormingsbenadering voor gelijktijdige visualisatie.
- Verzameling van ruwe gegevens uit bioassays.
- Verwerking van gegevens met behulp van de duo stat-software voor colockalisatie-analyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van extracellulaire polymere substanties (EPS) en bacteriën.
- Effectieve gegevensverwerking met behulp van aangepaste software.
- Inzichten in de structurele organisatie van orale biofilms.
- Verbeterd begrip van genexpressie in biofilms.
Conclusies
- Het ontwikkelde gereedschap kan worden aangepast voor breder biofilmonderzoek.
- Het combineren van beeldvormingstechnieken met software helpt bij het begrijpen van de complexiteit van biofilms.
- Deze aanpak kan leiden tot vorderingen in onderzoek naar orale gezondheid.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Oral biofilm research faces challenges in capturing dynamic structural and molecular interactions under complex oral conditions. An integrated analytical toolbox combining imaging, transcriptomics, and custom software enables mechanistic de-risking of virulence pathways in mutans streptococci. This supports target validation and predictive confidence in anti-caries therapeutic development by linking biofilm architecture to gene expression changes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking extracellular polysaccharide production to bacterial colonization dynamics in biofilms.
- Operational Value: Enables functional target validation through simultaneous visualization of EPS and bacteria via novel fluorescence labeling.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying gene expression patterns associated with sucrose and starch exposure that modulate pathogenicity.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biofilm models for downstream compound screening by standardizing growth on saliva-coated hydroxyapatite discs.
- Quantitative Output: Generates reproducible colocalization metrics via DuoStat software to assess spatial relationships between bacterial cells and EPS.
- Scalability: Facilitates high-throughput temporal evaluation and multi-species inclusion under controlled carbohydrate conditions.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase biofilm analysis to preclinical validation through temporal transcriptome profiling at 30 hours.
- Biomarker Alignment: Identifies differentially expressed gene subsets relevant to starch-sucrose interactions as potential virulence biomarkers.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions by filtering non-relevant genes via MDV software to focus on mechanistically relevant pathways.
Pipeline & Workflow Integration
The toolbox integrates across discovery biology, screening analytics, and translational research by linking structural imaging to molecular profiling in a reproducible workflow.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on how diet-derived carbohydrates influence biofilm architecture and microbial organization.
- Screening: Delivers assay readiness and quantitative outputs through standardized biofilm formation and dual-channel imaging.
- Analytics: Provides statistical analysis inputs (e.g., paired T-test with BRB array tool) and gene expression outputs for condition comparison.
- Translational Research: Connects biofilm development stages to gene expression changes, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for biofilm analysis adaptable to various microbial species and environmental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating EPS distribution with bacterial localization across biofilm depth.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through defined biofilm growth, staining, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of anti-virulence targets through integrated structural-transcriptomic analysis.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by highlighting condition-specific gene expression patterns linked to cariogenic potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, fluorescence labeling, and microarray data analysis.
- Dependent on MATLAB-based DuoStat and MDV software for colocalization and data mining.
- Needs cross-team standardization for biofilm growth, RNA extraction, and statistical analysis workflows.
- Adaptation considerations include model system compatibility and carbohydrate condition controls.
- Practical limitations include dependency on specific dyes (Dextran-conjugated LOR 647, Cyto9) and biofilm model reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
2:17
Fluorescent Labeling of Exopolysaccharides and Bacterial Cells in Biofilms
4:12
Biofilm Image Acquisition and Data Analysis
4:58
Biofilm Structural Analysis and Quantification
6:25
Transcriptome Analysis of Biofilms
9:51
Differential Gene Expression in S. mutans Biofilms Formed in the Presence of Different Dietary Carbohydrates
10:28
Conclusion
