Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van epitheelcellen van de luchtwegen om de toxische effecten van blootstelling aan sigarettenrook te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst trachea's van muizen te dissekeren en deze vervolgens te verteren in een pronase-oplossing. De tweede stap van de procedure is het verzamelen van de epitheelcellen en het kweken van de vloeibare cultuur.

De derde stap is het differentiëren van de culturen aan een lucht-vloeistofgrensvlak. De laatste stap van de procedure is het blootstellen van de epitheelcellen aan apicaal sigarettenrook aan het lucht-vloeistofgrensvlak. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een volledig gedifferentieerde monolaag van epitheelcellen laten zien middels immunofluorescentiemicroscopie.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van chronisch obstructieve longziekte, zoals de effecten van blootstelling aan sigarettenrook op de morfologie van CLIA en door sigarettenrook geïnduceerde biochemische markers van celbeschadiging. Begin één dag vóór de dissectie met de voorbereidingen voor deze procedure door het klaarmaken van hams F 12-medium met antibiotica en 20% F-B-S-M-T-E-C, een basismedium met antibiotica.

MTEC-medium met 5% FBS, DNA's one-solution, retinoïnezuur-stamonlossingen en MTEC-proliferatiemedium volgens de instructies in het geschreven protocol. Steriliseer alle chirurgische instrumenten die tijdens de dissectie worden gebruikt op de dag van de dissectie. Zorg ervoor dat het dissectiegebied schoon is en dat alle dissectie-instrumenten binnen handbereik zijn.

Steriliseer de weefselkweekkast. Werk vervolgens in de weefselkweekkast. Bereid een oplossing van 0,15% pronase.

Voeg 15 milligram pronase toe aan 10 milliliter hams. F 12 medium met antibiotica in een conische buis van 50 milliliter. Bewaar op ijs tot gebruik.

Muizenluchtwegen worden gedisseceerd uit muizen. Desinfecteer met behulp van standaard chirurgische procedures de buis met de trachea's en plaats deze in de weefkweekkap. Draag het tracheaweefsel over naar een Petrischaal van 100 millimeter met hams F 12-medium bevattende antibiotica. Gebruik steriele chirurgische pincetten om het bindweefsel van de trachea's te verwijderen.

Kloof vervolgens de schone trachea's over in de tweede Petri-schaal van 100 millimeter die hams. F 12-medium met antibiotica bevat. Gebruik dissectiescharen om de trachea's langs de verticale as door te snijden en het lumen bloot te leggen.

Breng de trachea's over naar de conische buis van 50 milliliter met 10 milliliter Pronase-oplossing en plaats deze in de koelkast om gedurende de nacht te incuberen bij vier graden Celsius. Bereid ten slotte collagen one-behandelde transwell-platen voor gebruik. Voeg de volgende dag 50 milligram collagen one per milliliter 0,02 N azijnzuur toe en pipetteer één milliliter van deze oplossing in elke put van een 12.

Was de wellplaat grondig. Wikkel de plaat in parafilm en laat deze een nacht bij kamertemperatuur in de weefkweekkap staan. De volgende dag.

Keer de buis met de muizenluchtwegen voorzichtig 10 tot 12 keer om. Laat de inhoud van de buis vervolgens nog 30 tot 60 minuten incuberen bij vier graden Celsius. Pipetteer, terwijl u in de weefselkweekkap werkt, 10 milliliters Hams F 12 medium met antibiotica in 20%FBS in de conische buis met het gedigereerde tracheale weefsel en keer deze 12 keer om.

Pipetteer vervolgens 10 milliliters hams F 12 medium met antibiotica in 20% FBS in elk van drie 15 milliliter conische buizen. Gebruik een steriele pasteurpipet om het tracheale weefsel van de pronase-oplossing over te brengen naar de eerste van de buizen met gesupplemeerd hams F 12 medium.

Zet de Pronase-oplossing op ijs, sluit de buis met het tracheaweefsel af en keer deze voorzichtig 12 keer om om te mengen. Draag vervolgens met de Pasteurpipet het tracheaweefsel over naar de tweede conische buis van 15 milliliter en keer deze buis 12 keer om. Herhaal de overdracht- en inversieprocedure met de laatste conische buis van 15 milliliter.

Gebruik tot slot de pasta-pipet om het tracheaweefsel te verwijderen en weg te gooien. Haal vervolgens de pronase-oplossing uit het ijs en voeg de drie volumes van 15 milliliter aangevuld hams F 12-medium toe aan de pronase-oplossing. Centrifugeer de sample in de gekoelde centrifuge bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten bij 1 400 toeren per minuut; gooi na centrifugatie de supernatant weg en pipetteer vervolgens ongeveer 100 tot 200 microliters DNA-oplossing 1 per trachea op het pellet en resuspendeer.

Resuspendeer door voorzichtig tegen de wand te tikken. Incubeer de cellen vijf minuten op ijs. Centrifugeer de buis vijf minuten bij 1.400 toeren per minuut bij 4 °C en verwijder het supernatant.

Pipetteer vervolgens acht milliliter MTEC-medium met 10% FBS op de pellet en resuspendeer de plaat. Incubeer de celsuspensie op een paria-plaat bij 37 °C in een atmosfeer van 95% lucht en 5% koolstofdioxide gedurende vijf tot zes uur. Dit is een negatieve selectiestap voor het verwijderen van fibroblasten.

Verzamel na incubatie de celsuspensie uit de paria-plaat en pipetteer deze in een conische buis van 50 milliliter. Spoel de plaat vervolgens twee keer met vier milliliter MTEC-medium dat 10%FBS bevat. Overbreng beide spoelingen naar de conische buis van 50 milliliter met de celsuspensie.

Pipetteer één milliliter van de celsuspensie in een einor-buisje. Bewaar dit aliquot voor cyto-spin analyse en celtellingcentrifuge. De 50 milliliter conische buis met de resterende 15 milliliter celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 1.400 toeren per minuut bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten.

Verwijder tijdens het centrifugeren de collageenoplossing uit de eerder voorbereide transwell-plaat en gooi deze weg. Laat de plaat vijf minuten drogen onder de zuigkast en was de plaat daarna twee keer met PBS na de laatste wasbeurt. Aspireer alle PBS en pipetteer na centrifugering 1,5 milliliters proliferatiemedium in het basale compartiment van de transwell.

Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in een geschikt volume proliferatiemedium om het uitplaten van 7,5 × 10⁴ tot 1 × 10⁵ cellen in 500 µL suspensie per well te faciliteren. Pipetteer 500 µL celsuspensie op het apicale oppervlak van de Transwell polycarbonaat membraaninsert. Incubeer de ondergedompelde MTEC-culturen gedurende zeven tot 10 dagen bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 95% lucht en 5% koolstofdioxide, waarbij het medium om de dag wordt ververst.

Meet de transepitheliale celweerstand met een intervalometer. Wanneer de epitheliale weerstand 1000 ohms per vierkante centimeter bereikt en de culturen confluent lijken, wordt dit omgezet in een LI-cultuur door het apicale medium te verwijderen.

Vervang daarnaast het basale medium door MTEC-basismedium met 2% nieuw serum en retinoïnezuur. Incubeer de culturen gedurende 10 tot 14 dagen bij 37 °C en 5% koolstofdioxide om differentiatie mogelijk te maken, waarbij het medium om de dag wordt ververst. Stel eerst de rookmachine in volgens de instructies van de fabrikant.

Noteer het gewicht van een ongebruikt pole flex-filter. Plaats het filter vervolgens in de roestvrijstalen inline houder van de bemonsteringsbuis die loopt van de bemonsteringspoort op de rookkamer naar de constante-stroompomp. Verbind de bemonsteringsunit met de gasmeter via een uitstroombuis met behulp van een CS-cel expositiesysteem.

Stel de apicale zijde van de transwell-culturen bloot aan de hoofdstroom van sigarettenrook van drie R4F research reference filter sigaretten. Stel de cellen bloot aan de rook van één tot twee sigaretten. Stel controleculturen gedurende een gelijke blootstellingsperiode bloot aan kamertlucht nadat het gewicht na gasbemonstering is bepaald.

Bij het pool flex-filter wordt de totale hoeveelheid materiaal die op het filter is afgezet in milligrammen genormaliseerd. Voor het totale bemonsterde luchtvolume levert de rook van één tot twee sigaretten doorgaans 100 tot 200 milligram per kubieke meter TPM op. Oogst na blootstelling aan de sigaretten de cellen en het basale medium voor verdere analyses.

Dit is een voorbeeld van een gezonde monolaag van respiratoire epitheelcellen van muizen, gekleurd voor nucleaire epitheelcel- en C-markers. Een succesvolle epitheelisolatie, proliferatie en differentiatie resulteert in een intacte monolaag met een kasseienachtige morfologie. De culturen zijn in wezen fibroblastvrij.

Deze elektronenmicrografieën zijn representatief voor gezonde MTEC-culturen en tonen de ultrastructuur van de verschillende celtypen en de CELIA-morfologie. Deze live-cell imaging-video toont de gezonde C-morfologie van MTEC-culturen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het isoleren van tracheale epitheelcellen van muizen, het differentiëren ervan in een lucht-vloeistofinterface en het blootstellen ervan aan mainstream sigarettenrook.