Name: Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-21T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 47 s
Description: Leer hoe je luchtweg-epitheelcellen isoleert uit muizentrachea en differentieert aan een lucht-vloeistofgrens om de toxische effecten van sigarettenrook op longgezondheid te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Emeka Ifedigbo voor technische bijstand en Dr Shivraj Tyagi voor waardevolle expertise. We danken ook de Harvard NeuroDiscovery Centrum voor hulp bij microscopie. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door een American Heart Association Predoctorale verlenen 09PRE2250120 aan Hilaire Lam, en het NIH subsidies, R01-HL60234, R01-HL55330, R01-HL079904, toegekend aan AMK Choi.

De algehele protocol vereist twee dagen voor de cel isoleren van dierlijk weefsel, 5-10 dagen voor de celproliferatie, en een extra 10-14 dagen voor de celdifferentiatie in lucht-water grensvlak. Een extra dag nodig is voor cel-blootstelling en het oogsten van de monsters. 1. Isolatie van Mouse tracheobronchiale epitheelcellen (MTEC). Let op: Alle procedures die hieronder worden beschreven zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite op Brigham and Women's Hospital / Harvard Medical School Area. Voordat u begint: <ul><li> Bereid Ham's F12 Media met antibiotica. Tot 250 ml Ham's F12 basale media (Cellgro) toe te voegen 2,50 ml van een 100 X penicilline / streptomycine (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) oplossing en 250 ul van een 1000 X fungizone oplossing. Bewaren bij 4 ° C gedurende maximaal 4 weken. </li><li> Bereid een oplossing van 0,15% pronase. Voeg 15 mg pronase tot 10 ml Ham's F12 Media met antibiotica. Het maken van verse en blijf op ijs tot gebruik. </li><li> Bereid een schoon werkoppervlak en steriele chirurgische instrumenten geschikt zijn voor kleine dieren een operatie, en een lamellaire weefselkweek kap voor cel-isolaties. Alle andere apparatuur wordt beschouwd als standaard voor dierlijke celkweek inclusief bevochtigde CO 2 incubators, koude kamer, tafelblad cel centrifuges, omgekeerde microscoop, en wegwerp plastic pipet en cultuur ware. </li><li> Bereid collageen I-oplossing (50 ug / ml in 0,02 N azijnzuur). Pipetteer 1,0 ml collageen oplossing in elk putje van een 12 goed transwell plaat (Corning). Wikkel in parafilm en laat een nacht staan ​​op een vlakke ondergrond bij kamertemperatuur. </li></ul><ol><li> Met behulp van een commercieel verkrijgbaar muizenstam (dat wil zeggen, C57Bl / 6, mannelijk 6-8 weken oud), euthanaseren muizen met een goedgekeurde methode van euthanasie, zoals CO 2-geïnduceerde narcose. Typisch 6 muizen levert genoeg cellen (1,5 tot 2,0 x 10 5 cellen / muis) om zaad een 12-well transwell plaat. </li><li> Spray de kadavers met 70% EtOH-oplossing om het veld te steriliseren. </li><li> Met schone chirurgische schaar en scalpel, verwijder de huid rond de tracheale gebied, en bloot de luchtpijp. Open de buik, snijden langs het borstbeen, en verwijder de ribbenkast. Verwijder weefsel tot het einde van de luchtpijp wordt blootgesteld. </li><li> Plaats luchtpijpen in een 50 ml conische buis met 30 ml Ham's F12 media met antibiotica, op het ijs. </li><li> In een steriele lamellair stroom kap, transfer tracheale weefsel een steriele 100 mm petrischaal met 10 ml Ham's F12 media met antibiotica. </li><li> Voorzichtig ontleden bindweefsel met een steriele pincet en chirurgische schaar. </li><li> Overdracht tracheale weefsel een nieuwe 100 mm petrischaal met 10 ml Ham's F12 media met antibiotica te spoelen. Snijd luchtpijpen langs de verticale as naar lumen bloot te leggen. </li><li> Overdracht luchtpijpen om een ​​50 ml buis met 10 ml 0,15% pronase oplossing en incubeer overnacht bij 4 ° C. </li><li> Op de tweede dag, zijn er klaar voor: <ul><li> Bereid een DNAse I-oplossing. Tot 18 ml Ham's F12 Media antibiotica toe te voegen 2 ml van een 10 mg / ml Bovine Serum Albumine (BSA) stock-oplossing, en 10 mg van ruwe pancreas DNAse I. Maak 1 mL porties en bewaar bij -20 ° C (ontdooid op ijs voor gebruik). </li><li> Bereid Ham's F12 media met antibiotica met 20% foetaal bovine serum (FBS). Tot 200 ml Ham's F12 basale media (Invitrogen) toe te voegen 50 ml warmte geïnactiveerd FBS, 2,5 ml van een 100 X penicilline / streptomycine (10 2 U/mL-10 2 mg / ml) oplossing, en 250 ul van een 1000 X fungizone oplossing . </li><li> Bereid MTEC Basic Medium met antibiotica. Naar 475,5 mL DMEM/F12 basic media (Cellgro) toe te voegen 7,5 ml 1 M HEPES-oplossing, 10 ml 200 mM glutamine oplossing, 2 ml van een 7,5% NaHCO 3 oplossing, 5 ml van een 100 X penicilline / streptomycine-oplossing, 500 pL van een 1000 X fungizone oplossing </li><li> Bereid MTEC medium/10% FBS. Tot 45 ml van MTEC basisch milieu met antibiotica, voeg 5 ml hitte geïnactiveerd FBS. </li></ul></li><li> Schud de buis (vanaf stap 1.8) 10-12 keer, en laat het gedurende 30-60 minuten staan ​​bij 4 ° C. </li><li> Voeg 10 ml Ham's F12 medium met 20% FBS en antibiotica aan de buis en rock 12 keer. </li><li> Bereid 3 15 ml conische buisjes met 10 ml Ham's F12 medium met 20% FBS en antibiotica. </li><li> Verwijder de luchtpijpen van pronase oplossing, afgezien van deze oplossing op het ijs. Overdracht luchtpijpen de eerste conische buis met Ham's F12 en omkeren buis 12 keer. Herhaal dit proces nog twee keer. </li><li> Combineer pronase oplossing met de drie bovenstaande vloeistoffen van stap 1.13 in een 50 ml buis. Gooi de resterende weefsel. </li><li> Centrifugeer bij 1400 tpm (390 xg, Eppendorf-5810R centrifuge zijn uitgerust met een A-4-62 rotor) gedurende 10 min bij 4 ° C, en gooi supernatant. </li><li> Voorzichtig resuspendeer de pellet in 1 ml DNAse-oplossing (100-200 pi / luchtpijp)en incubeer 5 minuten op ijs. </li><li> Centrifugeer bij 1400 tpm (390 xg) voor 5 min bij 4 ° C, en gooi supernatant. </li><li> Resuspendeer de cel pellet in 8 ml MTEC medium met 10% FBS </li><li> Plaat celsuspensie op Primaria Platen (Falcon). Incubeer bij 37 ° C in een atmosfeer van 95% lucht, 5% CO 2 voor 5 uur (Let op: dit is een negatieve selectie stap voor fibroblasten). </li><li> Verzamel celsuspensie van platen en twee keer spoelen platen met 4 ml MTEC met 10% FBS. Pool celsuspensie en wast samen in een 50 ml conische buis. </li><li> Conserve 1 ml voor Cytospin en cel tellen. Spin in een tabletop centrifuge gedurende 5 min bij 5000 rpm (Eppendorf 5415D). Verwijder de 500 pL en resuspendeer pellet in resterende supernatant. Gebruik 100 ul voor mobiele tellen van het gebruik van de trypan Blue vitale kleuring methode. Conserve vier fracties van 100 ul voor Cytospin analyse </li><li> Spin overige 15 ml celsuspensie bij 1400 tpm (390 xg) bij 4 ° C gedurende 10 minuten. </li></ol> 2. Vermeerdering en differentiatie van MTEC Op Lucht-water interface Bereid retinoïnezuur voorraad oplossingen. Stock oplossing A: Weeg Retinoïnezuur in het donker (de heer 300,44 g / mol) tot een 5 mM voorraad oplossing te maken in 95% EtOH. Bewaren in een folie gewikkeld buis bij -80 ° C. Indien nodig, voorbereiden Stock oplossing B (5 uM) door toevoeging van 50 ul Stock A, 500 pl BSA-oplossing (100 mg / ml) en 49,5 gebalanceerde zout mL Hank's oplossing (HBSS). Bewaren in een folie gewikkeld buis bij -80 ° C gedurende maximaal 4 weken. Bereid MTEC proliferatie medium met retinoïnezuur. Tot 45,7 mL MTEC basale media met antibiotica, voeg 2,5 mL hitte-geïnactiveerd FBS, 1 mL Retinoïnezuur Stock B, 250 pl Insuline-oplossing (2 mg / ml insuline in 4 mM HCl), 250 pi epidermale groeifactor-oplossing (5 ug / mL EGF in HBS met 1 mg / ml BSA), 200 pi runderen hypofyse-extract (15 mg / ml in HBS met 1 mg / ml BSA), 50 pi transferrine-oplossing (5 mg / ml in HBS transferrine met 1 mg / ml BSA ), 50 il cholera toxine-oplossing (100 mg / ml in HBS met 1 mg / ml BSA). Filter steriliseren laatste media bereiding en het gebruik binnen 2 dagen van voorbereiding. <ol><li> Verwijder de collageen-oplossing van transwell platen, laat staan ​​onder de motorkap voor 5 min, en wassen met PBS twee keer. </li><li> Na centrifugatie, resuspendeer de cel pellet in een geschikt volume van de proliferatie media (500 ui) om beplating van 7,5 x 10 4 x 10 -1.0 5 cellen per well te vergemakkelijken. Pipetteer 500 ui celsuspensie op het apicale oppervlak van de transwell polycarbonaat membraan te voegen. Voeg 1,5 mL van de proliferatie media om de basale compartiment van de transwell. </li><li> Incubeer de ondergedompelde MTEC culturen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 95% lucht, 5% CO 2 voor 7-10 dagen. </li><li> Wacht drie dagen voor het veranderen media de eerste keer. Verandering media om de andere dag. Monitor culturen door visuele inspectie en meting van transepithele cel verzet met behulp van een elektrode (EVOM Ohmvoltometer, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL). </li><li> Wanneer de cellen samenvloeiende verschijnen en epitheliale weerstand bereikt 1,000 Ω / cm 2, de cellen zijn klaar om te differentiëren op ALI. </li><li> Bereid MTEC basale medium met 2% NuSerum. Voeg NuSerum aan MTEC basisch medium tot een uiteindelijke concentratie van 2% V / V. Voeg retinoïnezuur Stock B tot een uiteindelijke concentratie van 1 x 10 -7 M voor gebruik. Bereid verse en gebruik het binnen 2 dagen. </li><li> Laat cel om onderscheid te maken gedurende 10-14 dagen, door het verwijderen van apicale media en het vervangen van de basale media met 750 pi MTEC basale medium met 2% Nuserum en retinoïnezuur. Wijzig de basale media en was de apicale kant met MTEC met 2% NuSerum om de andere dag. </li></ol> 3. Toepassing van sigarettenrook op gekweekte epitheelcellen <ol><li> Expose de apicale zijde van de transwell culturen om reguliere sigaret roken met behulp van een CS-cel-belichtingssysteem (EMI Instruments, Pittsburgh, PA). Zie Figuur 1 voor een foto van het apparaat. Zie tabel van specifieke reagentia en uitrusting voor technische specificaties. In het kort, het apparaat bestaat uit een peristaltische pomp die elke sigaret rookt in ~ 7-8 soezen, tekening in de mainstream rook in een polypropyleen lijn die is aangesloten op een geventileerde blootstelling kamer. De belichting kamer wordt gehandhaafd op 37 ° C door de verspreiding van water, en gehandhaafd op een atmosfeer van 5% CO 2 op een gasleiding. De cellen kunnen worden blootgesteld aan de rook met behulp van Kentucky 3R4F onderzoek referentie-filter sigaretten (The Tobacco Research Institute aan de Universiteit van Kentucky, Lexington, KY). Typisch cellen worden blootgesteld aan de rook 1-2 sigaretten, waardoor 100-200 mg / m 3 van de totale fijn stof (TPM). Controle culturen worden blootgesteld aan lucht in de ruimte voor een gelijke periode van blootstelling. </li><li> De TPM is gemeten volgens protocol van de fabrikant die bij de TE-10c roken machine (Teague Enterprises). In het kort, is een filter (Pallflex), geplaatst in een inline RVS houder op een steekproef buis die vanaf de bemonstering-poort op de rookkamer om een ​​constante stroom pomp (monstername-eenheid). Een uitstroom buis verbindt de monstername-eenheid met een gasmeter (Droge gasmeter, ONM61, 67, AEM). Het filter wordt gewogen voor en na de gasmonsters. De totale materiaal afgezet op het filter in mg is genormaliseerd voor het totale volume van de lucht bemonsterd. </li><li> De cellen kunnen vervolgens worden geoogst op elk gewenst tijdstip (dat wil zeggen, 0-24 uur) na blootstelling aan voor de standaard mobiele analytische procedures (dat wil zeggen, West-immunoblot analyse, mRNA-analyse, enz.) of microscopie (dat wil zeggen, confocale of elektronenmicroscopie). De cultuur media kunnen ook worden geanalyseerd voor cytokinen of LDH release voor cytotoxiciteit assays. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Succesvolle epitheel isolatie, proliferatie en differentiatie bij ALI moet opleveren een intact monolaag met een geplaveide morfologie. Transepithelilal cel weerstand van gezonde culturen moet ongeveer 1000-2000 Ω / cm 2. Figuur 2 geeft een monolaag van de muis respiratoire epitheelcellen gekleurd voor epitheliale cel en cilia markers onder controle omstandigheden en na de blootstelling aan sigarettenrook. Figuur 3 toont vertegenwoordiger electronenmicroscoop van gezonde MTEC culturen, voorstellende ultrastructuur en cilia morfologie. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Voorbereiding van de epitheliale cellen verloopt via drie fasen, een isolatie stap, een vermeerdering podium, en een differentiatie stadium lucht-vloeistof interface (regeling). Epitheliale cellen geïsoleerd worden van de muis luchtpijp, gezaaid op transwells waar ze zich vermenigvuldigen in ondergedompelde cultuur, en vervolgens omgezet in lucht-water grensvlak, waar ze volledig te onderscheiden. Experimenten worden meestal uitgevoerd op de 24 ste dag van continue cultuur. De foto toont een modelsysteem voor de blootstelling van gekweekte cellen van de reguliere sigaret roken. Een transwell ALI cultuur-systeem is geplaatst in een op maat gemaakte modulaire sigarettenrook aflevering systeem dat wordt gecontroleerd voor temperatuur, vochtigheid en CO 2. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2 Epitheliale celkweken werden gefixeerd en gekleurd voor de kernen (Hoechst 33258), F-actine (groen, Alexa Fluor-488-geconjugeerd Phalloidin). En de trilharen marker geacetyleerde α-tubuline (rood; Cy3-geconjugeerd secundair antilichaam). De onderste panelen tonen equivalent beelden van epitheelcellen die 4 uur na de blootstelling aan sigarettenrook (2 sigaretten, 150 mg / m 3). (B) Lactaat dehydrogenase (LDH) release werd gemeten in de basale medium 24 uur na blootstelling aan verschillende doses van sigarettenrook zoals aangegeven. <img src="/files/ftp_upload/2513/2513fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Lucht-water grensvlak kweken van epitheliale cellen geïsoleerd uit muizen tracheale epitheel differentiëren in verschillende subtypes die door transmissie elektronenmicroscopie (TEM) de kenmerken van de trilharen, basale, en niet-trilharen cellen 1 hebben. Deze cellen typeren pseudostratified ademhalingsepitheel. Figuur labels komen overeen met: bb: basale lichaamstemperatuur, een: axoneme, m: mitochondria, n: kern, s: substraat (polycarbonaat membraan), mv: microvili

<ol><li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, L1315-L1320 (2002).</li>
<li>Davidson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+epithelial+cells%3A+isolation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cyst.+Fibros%22%5BJournal%5D)">Murine epithelial cells: isolation and culture.</a> J. Cyst. Fibros. 2, Suppl 3. 59-62 (2004).</li>
<li>Davidson, D. J., Kilanowski, F. M., Randell, S. H., Sheppard, D. N., Dorin, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+culture+model+of+differentiated+murine+tracheal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A primary culture model of differentiated murine tracheal epithelium.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 279, L766-L778 (2000).</li>
<li>Rabe, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.%3B+Global+Initiative+for+Chronic+Obstructive+Lung+Disease.+Global+strategy+for+the+diagnosis%2C+management%2C+and+prevention+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%3A+GOLD+executive+summary%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">et al.; Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary.</a> Am. J Respir. Crit. Care Med. 176, 532-555 (2007).</li>
<li>Macnee, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chest+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease.</a> Clin. Chest Med. 28, 479-513 (2007).</li>
<li>Tuder, R. M., Yoshida, T., Arap, W., Pasqualini, R., Petrache, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art.+Cellular+and+molecular+mechanisms+of+alveolar+destruction+in+emphysema%3A+an+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">State of the art. Cellular and molecular mechanisms of alveolar destruction in emphysema: an evolutionary perspective.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 3, 503-510 (2006).</li>
<li>Yao, H., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+concepts+on+the+role+of+inflammation+in+COPD+and+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Current concepts on the role of inflammation in COPD and lung cancer.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 375-383 (2009).</li>
<li>van der Toorn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+irreversibly+modifies+glutathione+in+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke irreversibly modifies glutathione in airway epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 293, L1156-L1162 (2007).</li>
<li>Slebos, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+localization+and+function+of+heme+oxygenase-1+in+cigarette+smoke-induced+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial localization and function of heme oxygenase-1 in cigarette smoke-induced cell death.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 36, 409-417 (2007).</li>
<li>Kim, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+proteins+regulate+cigarette+smoke+induced+apoptosis%3A+protective+role+of+heme+oxygenase-1%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic proteins regulate cigarette smoke induced apoptosis: protective role of heme oxygenase-1.</a> Autophagy. 4, 887-895 (2008).</li>
<li>Chen, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egr-1+regulates+autophagy+in+cigarette+smoke-induced+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Egr-1 regulates autophagy in cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease.</a> PLoS ONE. 3, e3316-e3316 (2008).</li>
<li>Okuwa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+micronucleus+assay+for+cigarette+smoke+using+a+whole+smoke+exposure+system%3A+A+comparison+of+smoking+regimens%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Toxicol+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro micronucleus assay for cigarette smoke using a whole smoke exposure system: A comparison of smoking regimens.</a> Exp Toxicol Pathol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>St-Laurent, J., Proulx, L. I., Boulet, L. P., Bissonnette, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+two+in+vitro+models+of+cigarette+smoke+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Inhal.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of two in vitro models of cigarette smoke exposure.</a> Inhal. Toxicol. 21, 1148-1153 (2009).</li>
<li>Watson, A. M., Benton, A. S., Rose, M. C., Freishtat, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+alters+tissue+inhibitor+of+metalloproteinase+1+and+matrix+metalloproteinase+9+levels+in+the+basolateral+secretions+of+human+asthmatic+bronchial+epithelium+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Investig.+Med%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke alters tissue inhibitor of metalloproteinase 1 and matrix metalloproteinase 9 levels in the basolateral secretions of human asthmatic bronchial epithelium in vitro.</a> J Investig. Med. 58, 725-729 (2010).</li>
<li>Rennard, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cigarette+smoke+in+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cigarette smoke in research.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 479-480 (2004).</li>
<li>Shapiro, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smoke+gets+in+your+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Smoke gets in your cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 31, 481-482 (2004).</li>
</ol>

Het protocol beschrijft de isolatie van de muis tracheale epitheelcellen is een bewerking van de protocollen van U et al.., 1, en ​​anderen 2-3 met wijzigingen. Zoals met elk protocol beschrijft cel isolatie, het meest kritische aspect is om besmetting van bacteriën of schimmels te vermijden door gebruik te maken strikte aseptische technieken. Een tweede kritische stap is om te voorkomen dat fibroblast verontreiniging van de culturen, die kan worden vermeden door zorgvuldige dissectie van ...

* Het roken van sigaretten machine is een op maat ontworpen en gefabriceerd 14 &quot;x14&quot; x20 &quot;Dual chambered en water bemanteld lichte tint duidelijk bewijs 1 / 2&quot; dik polycarbonaat Lexan kamer voor de blootstelling aan sigarettenrook met instelbare temperatuur, waterniveau sensor geregeld uitgeschakeld systeem. Een sigaret roken / puffend unit is geïnstalleerd voor een variabele sigaret puffend tarieven. Wanneer het apparaat in gebruik is, het bootst een incubator in de zin dat de temperatuur, vochtigheid en koolstofdioxide worden gecontroleerd in het systeem. Het systeem bestaat uit: (I) een aangepaste dubbele kamer / water bemanteld eenheid die een gecontroleerde omgeving voor weefselkweek experimenten in stand houdt. (II) een digitale zware, hoge precisie dubbele pomp temperatuur van het water circulatiepomp systeem met waterniveau-sensor en de temperatuur controle (III) een het roken van sigaretten unit met puffend pomp. (IV) een pomp cyclus sensor controlepercentage cycler (IV) een roestvrij stalen hoge precisie in-Line filterhouder. (V) een afneembaar deksel gemonteerd 11 / 2 &quot;size axiale uniformiteit sigarettenrook mengventilator. (VI) is een middelgrote waterbad met een montagebeugel voor het water circulatiepomp. (VII) A 1 / 2&quot; dik plexiglas tray met beugels voor de trekje pomp en houder voor sigarettenas verzamelaar. Deze machine, zoals beschreven kan worden vervangen met gelijkaardige commercieel beschikbare roken machines zoals de soort die beschikbaar zijn vanaf TSE-systemen ( <a href="http://www.tse-systems.com">www.tse-systems.com</a> ).

isolatie van mouse respiratory epitheelcellen en blootstelling aan experimentele cigarette smoke bij air liquid interface

Isolation of Mouse Respiratory Epithelial Cells and Exposure to Experimental Cigarette Smoke at Air Liquid Interface  

Pulmonale epitheliale cellen kunnen worden geïsoleerd uit de luchtwegen van muizen en gekweekt bij de lucht-vloeistof interface (ALI) als een model van gedifferentieerde respiratoire epitheel. Een protocol is beschreven voor het isoleren en het blootstellen van deze cellen naar mainstream sigarettenrook (CS), om epitheliale cel responsen studie naar CS blootstelling. Het protocol bestaat uit drie delen: de isolatie van epitheelcellen in de muis luchtpijp, het kweken van deze cellen in de lucht-vloeistof interface (ALI) als volledig gedifferentieerde epitheliale cellen, en de levering van geijkte mainstream CS om deze cellen in cultuur. Het ALI cultuur systeem maakt het mogelijk de cultuur van respiratoire epitheel onder omstandigheden die beter hun fysiologische omgeving dan de gewone vloeibare cultuur-systemen lijken. De studie van moleculaire en cellulaire reacties op long exposure CS is een cruciaal onderdeel van het begrijpen van de invloed van het milieu luchtvervuiling op de menselijke gezondheid. Onderzoeksresultaten op dit gebied kan uiteindelijk bijdragen aan inzicht in de etiologie van chronische obstructieve longziekte (COPD), en andere tabak gerelateerde ziekten, die grote mondiale gezondheidsproblemen vertegenwoordigen.

Pulmonale epitheliale cellen kunnen worden geïsoleerd uit de luchtwegen van muizen en gekweekt bij de lucht-vloeistof interface als een model van gedifferentieerde respiratoire epitheel. Een protocol is beschreven voor het isoleren, kweken en het blootstellen van deze cellen om te mainstream sigarettenrook, om moleculaire reacties studie om deze milieu-toxine.

Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface

Pulmonale epitheelcellen kunnen worden geïsoleerd uit de luchtwegen van muizen en worden gekweekt op een lucht-vloeistofgrensvlak (air-liquid interface, ALI) als model voor gedifferentieerde ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van epitheelcellen van de luchtwegen om de toxische effecten van blootstelling aan sigarettenrook te bestuderen. Dit wordt bereikt door eerst trachea's van muizen te dissekeren en deze vervolgens te verteren in een pronase-oplossing. De tweede stap van de procedure is het verzamelen van de epitheelcellen en het kweken van de vloeibare cultuur.De derde stap is het differentiëren van de culturen aan een lucht-vloeistofgrensvlak. De laatste stap van de procedure is het blootstellen van de epitheelcellen aan apicaal sigarettenrook aan het lucht-vloeistofgrensvlak. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die een volledig gedifferentieerde monolaag van epitheelcellen laten zien middels immunofluorescentiemicroscopie.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het veld van chronisch obstructieve longziekte, zoals de effecten van blootstelling aan sigarettenrook op de morfologie van CLIA en door sigarettenrook geïnduceerde biochemische markers van celbeschadiging. Begin één dag vóór de dissectie met de voorbereidingen voor deze procedure door het klaarmaken van hams F 12-medium met antibiotica en 20% F-B-S-

isolation-mouse-respiratory-epithelial-cells-exposure-to-experimental

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Een sterk gezuiverde bereiding van de muis long dendritische cellen wordt beschreven. Specifieke aandacht wordt gegeven aan de isolatie van de conventionele dendritische cel subset.

Isolatie van Mouse Lung dendritische cellen

Het doel van dit protocol is om geautomatiseerde methoden te bieden om chronische longpathologieën te kwantificeren in een muismodel van COPD. Het protocol omvat het blootstellen van muizen aan sigarettenrook (CS), het meten van longfunctie, het opblazen van de longen en het gebruik van morfometrische methoden om emfyseem en kleine luchtwegremodellering bij muizen te meten.

Geautomatiseerde Meting van longemfyseem en Kleine luchtweg remodeling in sigarettenrook blootgesteld Muizen

Het doel van dit protocol is om humane organotypische 3D bronchiale en nasale weefselmodellen bloot te stellen aan mainstream sigarettenrook (CS) bij de lucht-vloeistofinterface. De impact van CS op de weefsels wordt vervolgens onderzocht met behulp van een cytochrome P450 activiteitsassay, een trilhaarcellenmeting en een systeembiologie-aanpak.

Effectbeoordeling van herhaalde blootstelling van Organotypische 3D bronchiale en neusweefsel Cultuur Modellen naar Whole Sigarettenrook

Hier beschreven is een protocol om te bestuderen hoe sigarettenrook extract bacteriële kolonisatie in longepelliële cellen beïnvloedt.

Het bestuderen van effecten van sigarettenrook op pseudomonas infectie in longepitheelcellen

Dit protocol toont de studie van de pathofysiologische effecten van sigarettenrook (CS) met een in eigen huis gebouwd inhalatiesysteem (WBI) voor het hele lichaam (WBIS). Dit systeem kan dieren blootstellen aan CS onder gecontroleerde herhaalbare omstandigheden voor onderzoek naar CS-gemedieerde effecten op longemfyseem en hematopoiese.

Blootstelling aan sigarettenrook bij muizen met behulp van een inhalatiesysteem voor het hele lichaam

In dit artikel werden primaire longendotheelcellen geïsoleerd en gekweekt uit neonatale muizen.

Isolatie van primaire longendotheelcellen van muizen

Hier wordt een reproduceerbare, betaalbare en robuuste methode gepresenteerd voor de isolatie en uitbreiding van primaire bronchiale epitheelcellen voor biobanking op lange termijn en het genereren van gedifferentieerde epitheelcellen door cultuur op de lucht-vloeistofinterface.

Het isoleren van bronchiale epitheelcellen uit gereseceerd longweefsel voor biobanking en het opzetten van goed gedifferentieerde lucht-vloeistof interfaceculturen

Hier beschrijven we een in vitro model voor het isoleren en differentiëren van luchtwegepitheelcellen van muizen, waarbij we ons richten op hun acclimatisatie aan chronisch sigarettenrookextract (CSE). Het model kan worden gebruikt om de multi-omics-impact van CSE uitgebreid te karakteriseren, wat mogelijk inzicht geeft in de cellulaire reacties onder chronische blootstelling aan rook.

In vitro model voor het bestuderen van differentiatie en veranderingen van multi-omics op muizen luchtwegepitheelcellen gestimuleerd met sigarettenrookextract

Dit protocol beschrijft de isolatie van levende immuun- en niet-immuunpopulaties uit de muizenlong in een stabiele toestand en na griepinfectie. Het biedt ook poortstrategieën voor het identificeren van subsets van epitheelcellen en myeloïde cellen.

Isolatie van levende myeloïde en epitheelcelpopulaties uit de muizenlong

Dit protocol biedt een op flow cytometrie gebaseerde methode om levensvatbare alveolaire type II epitheelcellen (AECII) te isoleren uit neonatale, juveniele of volwassen muislongen (geïnfecteerd of niet-geïnfecteerd). Deze aanpak maakt downstream moleculaire en/of functionele studies van AECII mogelijk om hun rol tijdens longontsteking en infectie te identificeren.

Isolatie van alveolaire Type II epitheelcellen uit neonatale, juveniele en volwassen muislongen die zich kunnen aanpassen aan infectieuze experimentele omgevingen

Leer hoe je luchtweg-epitheelcellen isoleert uit muizentrachea en differentieert aan een lucht-vloeistofgrens om de toxische effecten van sigarettenrook op longgezondheid te bestuderen.

Isolatie van Mouse Respiratory epitheelcellen en Blootstelling aan Experimentele Cigarette Smoke bij Air Liquid Interface

Meer video's verkennen