Het verzamelen van variabele concentratie Isothermische Titration Calorimetrie Datasets om Binding mechanismen bepalen

Het algemene doel van deze procedure is om het juiste fysieke model te identificeren dat de binding van een macromolecuul aan zijn ligand beschrijft en om de bijbehorende thermodynamische parameters te bepalen. Dit wordt bereikt door eerst een voorraadoplossing van het macromolecuul te bereiden via uitgebreide dialyse. De betreffende ligand wordt vervolgens opgelost in de uiteindelijke dialysebuffer, waarna de concentraties van alle componenten in de tweede stap worden bepaald.

De macromolecuul- en ligandmonsters worden zorgvuldig verdund tot een reeks verschillende concentraties. Vervolgens wordt een reeks isotherme titratiecalorimetrie-experimenten, of ITC-experimenten, uitgevoerd bij verschillende concentraties van zowel het ligand als het eiwit om in de laatste stap van de procedure een reeks ITC-isothermen te genereren. Er wordt een globale analyse van de reeks experimenten uitgevoerd met behulp van verschillende fysische modellen, waarbij het model met de beste algehele overeenstemming als correct wordt aangemerkt.

Vandaag laat ik u een methode zien die kan helpen bij het beantwoorden van biofysische vragen, zoals hoe eiwitmoleculen hun liganden binden, en die nauwkeurige metingen kan leveren van bindingsparameters zoals entropie, enthalpie en associatieconstanten. Zuiver vóór de start van dit protocol het eiwit van belang; het macromolecuul dat in deze demonstratie wordt gebruikt is een immuno GLYCOSIDE N six prime, een subtle transferase one I of een C six prime one I. Begin met het bereiden van vier liter dialysebuffer en koel dit af tot vier graden Celsius. Dialyse vervolgens een klein volume van een macromolecuuloplossing.

In dit geval worden vijf milliliter 400 µM AAC C 6',1I in 1,3 liter dialysebuffer bij 4 °C gebracht. Dit kan worden uitgevoerd in een koelruimte of een koelkast; vervang de buffer elke acht uur en dialyseer in totaal drie keer. Bewaar de uiteindelijke dialysevloeistof.

Filter 750 milliliters van de uiteindelijke dialysevloeistof door een 0,45 micron cellulosefilter en bewaar dit bij vier graden Celsius. Deze buffer, voortaan aangeduid als de loopbuffer, wordt gebruikt voor spoelingen en als verdunningsmiddel. Spoel voor de monsters een 0,2 micron spuitfilter grondig door met de loopbuffer.

Breng het eiwitmonster aan en filter dit. Verzamel het monster voorzichtig in een conische buis voordat u de eiwitoplossing bewaart, en bepaal de eiwitconcentratie met een standaard eiwitassay. In dit geval wordt de eiwitconcentratie gemeten via ABSORPTIE bij 280 nanometers en wordt de enzymconcentratie berekend.

Bewaar het eiwit op een manier die de stabiliteit op lange termijn maximaliseert, met gebruik van een extinctiecoëfficiënt gegenereerd door de EXI-proteomiekserver. AAC C six prime one eye moet bij vier graden Celsius worden bewaard, aangezien het geen activiteit behoudt na invriezen en ontdooien. Los vervolgens de ligand en de runningbuffer op. Voor deze demonstratie werden vier milligram acetyl-co-enzym A opgelost in 200 microliters runningbuffer om een 25 millimolaire voorraadoplossing te maken.

Deze ligand kan bewaard worden bij min 78 graden Celsius tot aan het gebruik voor de bereiding van de ITC-monsters. Bereken eerst de enzymconcentratie om een C-waarde van 64 te verkrijgen, zoals beschreven in het geschreven protocol voor AAC six prime one I. Dit komt overeen met een concentratie van 192 micromolar. Bereid een oplossing van 2 milliliter van het macromolecuul bij deze concentratie door de stockoplossing te verdunnen met de gefilterde running buffer FIA settle co-enzym a. Ontdooi de acetal co-enzym a-oplossing in een ijswaterbad. Zodra de acetal co-enzym a-oplossing is ontdooid, voorzichtig mengen. Bereken de concentratie van de ligandoplossing door de macromolecuulconcentratie te vermenigvuldigen met het aantal bindingsplaatsen en vervolgens met 10.

Bereid de acetyl-co-enzym A-oplossing voor door 80 µL van de 25 mM ACE-co-enzym A-stockoplossing toe te voegen aan 420 µL runbuffer en te mengen. Overbreng de verdunde acetyl-co-enzym ACE-oplossing naar een pipetteervulbuis en bewaar de resterende 25 mM stockoplossing bij -78 °C. Ontgas de AC6'-1I- en acetyl-co-enzym A-oplossingen onder vacuüm gedurende vijf minuten bij 19 °C, wat één graad Celsius onder de gewenste experimentele runtemperatuur ligt.

Om de injectiespuit in te stellen, plaatst u de spuit in een spuithouder totdat de vooraf gemonteerde spuitklem zich op dezelfde hoogte als de houder bevindt. Schuif de tweede spuitklem over de injectiespuit tot deze stevig tegen de onderkant van de spuithouder is gedrukt. Draai de klem voorzichtig vast met de meegeleverde 0,05 inch kogelsleutel (inbus).

Plaats vervolgens de spuitenhouder in de pipethouder. Schuif de pipetinjector voorzichtig in de injectiespuit en zorg ervoor dat de punt van de zuiger direct in de opening van de spuit wordt gevoerd. Draai, zodra deze volledig is ingebracht, de borgring van de spuitenhouder in de pipetinjector.

Voordat de A a C six prime one eye eiwitmonsteroplossing wordt geladen, dient de monstercel te worden gewassen met ten minste 50 milliliters loopbuffer met behulp van het bij het instrument meegeleverde celwas-systeem. Verwijder de resterende buffer uit de monstercel door aspiratie met een glasspuit van 2.5 milliliter met een lange naald. Verwijder de oplossingen uit het ontgassingsvacuüm met een tweede schone, droge lange naald.

2,5 milliliter spuit. Trek voorzichtig minimaal 1,8 milliliter van het A a C six prime one eye eiwitmonster op in de spuit. Let erop dat er geen luchtbellen ontstaan.

Zodra de spuit is gevuld met het eiwitmonster, steekt u de naald in de monstercel en raakt u voorzichtig de bodem van de cel aan. Til de naald ongeveer één millimeter op en injecteer het monster voorzichtig in de cel totdat er bovenaan de monstercel overtollige vloeistof zichtbaar is. Om eventuele ingesloten luchtbellen uit de cel te spoelen, tilt u de naald ongeveer één centimeter op, terwijl u ervoor zorgt dat er vloeistof in de overloop blijft staan, en trekt u snel ongeveer 0,25 milliliters van de oplossing op en injecteert u deze opnieuw.

Schuif de naald nu voorzichtig omhoog langs de zijkant van de overloop. In de monsterput zal de naald tegen een rand stoten. Trek alle vloeistof boven deze rand weg, aangezien de rand de gewenste hoogte voor de loopoplossing aangeeft.

Om de injectiespuit te vullen, bevestigt u de plastic slang van de vulspuit aan de vulpoort en brengt u de punt van de zuiger naar de bovenkant van de vulpoort. Plaats vervolgens de vulbuis van de pipet met de ligandoplossing van de DGA's onderaan de pipethouder. Controleer of de punt van de spuit de bodem van de vulbuis niet raakt en trek de oplossing langzaam in de spuit totdat er een kleine hoeveelheid in de slang van de vulspuit stroomt.

Sluit vervolgens de vulpoort door de plunjerpunt te laten zakken. Dit gebeurt door op de knop om de vulpoort te sluiten te klikken. Verwijder daarna eventuele luchtbellen die tijdens het laden gevangen kunnen zijn geraakt.

Voer een spoeling en vulling uit door op de knop 'purge refill' te klikken. Herhaal dit proces in totaal drie keer. Zodra het spoel- en vulproces is voltooid, verwijdert u de vulbuis uit de pipethouder en veegt u de tip van de spuit voorzichtig schoon met laboratoriumpapier.

Laat nu de spuit van de pipetset in het monster zakken. Wees voorzichtig en ga langzaam te werk, aangezien de naald gemakkelijk kan buigen. Zorg ervoor dat de spuit volledig is ingevoerd door op de basis van de vergrendelingsring te drukken.

Zodra de spuit is vastgezet, stelt u de gewenste bedrijfstemperatuur in en selecteert u een referentievermogen dat iets hoger is dan de maximaal verwachte warmtestroom bij injectie. In dit voorbeeld worden 20 °C en 20 µcal/s respectievelijk gebruikt als bedrijfstemperatuur en referentievermogen. Programmeer vervolgens de gewenste injectievolumes en vertragingstijden.

Hier worden 28 injecties gebruikt, waarbij de eerste een volume van 2 µL heeft met een vertraging van 62 s, en de daaropvolgende injecties een volume van 10 µL hebben met vertragingen van 332 s. Het hier getoonde experiment vormt de basis voor het genereren van een dataset bij een enkele concentratie om de benodigde aanvullende curven te genereren. Herhaal dit proces met afnemende concentraties van het macromolecuul en het ligand.

Zorg ervoor dat alle macromolecuul- en ligandmonsters afkomstig zijn van dezelfde stamoplossing om fouten in de concentraties te minimaliseren. Hier wordt de ruwe isothermische titratiecalorimetrie-curve getoond, gegenereerd door de titratie van 3,86 millimolair ligand acetyl-co-enzym A in 192 micromolair van het micro-molecuul A A C zes prime een.

Geïntegreerde waarden van de oog-sensor werden gebruikt om de bindingsparameters te bepalen met een sequentiële fit voor twee bindingsplaatsen. Deze grafiek toont de isothermen gegenereerd door ITC van verschillende concentraties ACE Coenzyme A en AAC C six Prime One Eye. De experimentele gegevens, weergegeven door open cirkels, zijn gefit aan zowel een onafhankelijk model met twee sets bindingsplaatsen als een sequentieel model met twee bindingsplaatsen.

Er is een betere overeenstemming zichtbaar bij het sequentiële model met twee bindingsplaatsen. De gebruikte proteïneconcentraties zijn gedefinieerd in de begeleidende tekst. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om zeer nauwkeurig te zijn met de verdunning, aangezien veranderingen in de concentraties een drastische impact op de resultaten kunnen hebben.