Name: Een strategie om de Novo Mutaties Leg in voorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: Ontdek een strategie om de novo mutaties te identificeren in veelvoorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie met behulp van sequencing en bio-informatica. Deze methode helpt onderzoekers bij het valideren van kandidaatgenen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We danken onze financieringsbronnen Genome Canada en Genome Quebec, en de Universite de Montreal alsmede de financiering van de Canadese Stichting voor Innovatie voor de financiering van onze &#39;Synapse om Disease&#39; (S2D) project.

1. Selectie van ziekte die kan worden veroorzaakt door de novo mutaties Een ziekte die overeenkomt met de volgende criteria kan aansluiten bij de de novo mutatie hypothese: <ol><li> De reproductieve conditie is verminderd. </li><li> De frequentie van de ziekte is relatief hoog en constant, ondanks zeer uiteenlopende omgevingen. </li><li> De ziekte is geassocieerd met een hoger vaderlijke leeftijd. </li><li> De klassieke linkage en associatie studies niet tot een significante fractie van de ziekte erfelijkheid te verklaren. </li><li> De dubbele concordantie gegevens ondersteunen een de novo model. </li></ol> Analyse van de waarschijnlijkheid dat een veel voorkomende ziekte, waar de novo mutaties kunnen voor een deel verklaren de genetische basis is een belangrijke eerste stap. 2. Selectie van de gevallen en DNA-monsters Selectie van geschikte monsters is van cruciaal belang voor het succes van de identificatie van de novo mutaties. Het maximaliseren van de kans op het vinden de novo mutaties, raden wij u het volgende: <ol><li> Selecteer de gevallen met vroege leeftijd van begin, ernstige fenotype, met onaangetast ouders, oudere vaders en zonder uitgebreide familie geschiedenis van de ziekte. </li><li> Kies patiënten bij wie de beschikbare DNA's voldoende zijn om de studie uit te voeren. Vooral van belang is de beschikbaarheid van DNA van een primaire cel bron die niet werd onderworpen aan het kweken (bijv. bloed of speeksel DNA DNA), </li><li> De beschikbaarheid van beide ouders DNA is van cruciaal belang om de mutatie transmissie status (erfelijk versus de novo) te bepalen. De beschikbaarheid van extra aangetast cohorten en normale controles is noodzakelijk voor genetische validatie studies als kandidaat-genen worden geïdentificeerd. </li><li> Schat de steekproefgrootte op basis van de mutaties snelheid, de hoeveelheid genen te screenen en de raming van de fractie van de zaken die kunnen voortvloeien uit een de novo mutatie. </li></ol> 3. Gen resequencing; twee belangrijke benaderingen <ol><li> Hoge kwaliteit lage throughput sequencing Deze aanpak is gebaseerd op de kandidaat-genen benaderingen. <ol><li> Selectie van kandidaat-gen (s) Selecteer de beste kandidaat-genen op basis van een score systeem dat is gebouwd op zes belangrijke criteria. Vervolgens berekent het totaal dat overeenkwam met de som van alle toegekende punten met behulp van de zes criteria vermeld in tabel 1. Zie het voorbeeld van ons project in figuur 1 van geselecteerde en niet geselecteerde genen distributie. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534table1.jpg" alt="Tabel 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Tabel 1"> Tabel 1. Criteria voor de selectie van kandidaat-gen <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Grafiek toont de verdeling van de geselecteerde en niet geselecteerde genen voor sequencing in ons project. Wij kregen een verdeling van genen in volgorde van de kandidaat-eigenschappen door het sorteren van genen op basis van hun score waarde. Bijvoorbeeld SHANK3 en NRXN1 genen, twee genen die we hebben gevonden de novo mutatie, had een score 7 en 6 (maximum is 12). </li><li> Ontwerp met behulp van primers Primers3 software via Exonprimer. Alleen coderend gebied en splice knooppunt moeten worden gedekt met een extra 50 basenparen aan elke kant van het exon. </li><li> Optimaliseren van PCR-condities voor de keuze van de Taq, reactie volume, enz. </li><li> Optimaliseren van alle PCR-fragmenten </li><li> Amplify 5 ng genomisch DNA uit bloedmonsters volgens standaardprocedures </li><li> Voordat u voor sequencing, doe kwaliteitscontrole van uw PCR-producten door het laden van een 2% agarose gel. Geselecteerde willekeurig monsters. </li><li> Volgorde van de PCR-producten op een DNA Analyzer op een streng. Een fragment wordt als succesvol volgorde als de analyse van meer dan 90% van de sporen is mogelijk. Dit is van toepassing voor een grootschalige screening. </li><li> Varianten Detectie <ol><li> Gebruik tools voor detectie en genotypering van genomische variaties zoals PolyPhred, Polyscan en mutatie Surveyor. Een combinatie van meer dan 2 detectie-instrumenten is ideaal. Bijvoorbeeld PolyPhred v.5 en PolyPhred v.6 met de standaard instellingen niet detecteren dezelfde variaties. Polyscan v.3 heeft een hogere false positive mutatie tarief voor SNPs (96%) en minder voor de INDELs (93%). PolyPhred V.6 niet ontdekt de meerderheid van de ware INDELs, maar hebben een vals-positieve mutatie tarief (voor INDELs) lager dan Polyscan v.3 totaal (90%). We moeten verwijderen de optie van SNP detectie voor Polyscan v.3 en houden zowel PolyPhred v.5 en PolyPhred v.6 voor variant detectie. Mutatie Surveyor en Polyscan zijn beter voor het opsporen van indels. Opmerking: De optie van de SNP-detectie mogen niet worden toegepast bij het gebruik van Polyscan. Alleen de "indel" optie moet worden ingeschakeld. Polyscan gegenereerd om een ​​groot aantal vals positieve voor SNP-detectie. </li><li> Voor elke unieke roman exonic varianten gedetecteerd, handmatig te bevestigen door reamplifying het fragment en resequencing de proband en beide ouders met behulp van reverse en forward primers aan een technisch artefact te elimineren. </li></ol></li></ol></li><li> Hele exome sequencing Deze aanpak is een high throughput sequencing gericht op de meerderheid van de coderende gebieden van het menselijke genoom. We zijn nu op dit moment gebruik van deze nieuwe aanpak in ons lab, het versnellen van de detectie van potentiële kandidaat-genen. <ol><li> Bestel de "SureSelect Human Alle Exon" gericht op het coderende gebied van meer dan 16.000 genen (50 MB van het genoom), ontworpen door Agilent of een ander soortgelijk product door anderen, zoals Roche. Voorafgaand aan de vast te leggen kit bestellen, moet de volgorde platforms te bepalen (Illumina vs vast). </li><li> Doe de vangst volgens het protocol Agilent </li><li> Volgorde het product op uw eigen beschikbare next-generation platform </li><li> Variant detectie van de hele exome sequencing: Diverse bioinformatica tools voor detectie en genotypering van genomische afwijkingen van de next-generation sequencing platform beschikbaar zijn, zoals BWA, Bfast, Bioscope die de uitlijning zal presteren. Waarna extra vrij beschikbare downstream tools (bijvoorbeeld SAM gereedschap, Varscan, Annovar) zou het nodig had om te bellen en annoteren van de varianten. Commerciële software die volgorde uitlijning en variant bellen en annotatie bevat zijn ook beschikbaar, zoals, NextGen (Softgenetics), CLC Bio, en anderen </li></ol></li></ol> 4. Genomic varianten prioritering Geïdentificeerde varianten worden vervolgens geprioriteerd voor de follow-up op basis van hun waarschijnlijkheid in het zijn de novo en schadelijk zijn voor eiwit of mRNA de functie en / of structuur. De variant follow-up prioriteiten voor de detectie van de novo variant moet worden als volgt: <ol><li> Unieke variaties (een keer waargenomen in een enkel geval) </li><li> Variaties niet in de ouders </li><li> Eiwit-truncerende variaties: onzin, indels leidt tot frameshift en splicing mutaties. </li><li> Missense en stille variatie voorspeld functioneel storend (bijvoorbeeld invloed hebben op mRNA splicing). Gebruik Polyphen, SIFT en Panther voor functionele voorspelling effect op het eiwit. </li></ol> Als u hele exome sequencing, kan de selectie van kandidaat-genen gebruikt worden als een strategie voor de prioriteitstelling varianten voor verdere studie. 5. Genetische validatie <ol><li> Resequence het hele gen in andere patiënt gevallen (om andere oorzakelijke mutaties te identificeren) en in de controlegroep. De controlemonsters zal worden gebruikt om allelische frequenties van de prioriteit varianten te evalueren. Elk gen die ten minste twee verschillende de novo schadelijke mutaties (onzin, splicing, frameshifts, en voorspelde schade missense) gevonden in verschillende patiënten (maar niet in controle monsters of openbare databases) moet sterk worden prioriteit voor verdere validatie studies. Dit omvat: 1) het testen voor een mogelijke splicing defect in lymfoblastoïde cellijnen afgeleid van de patiënt. In onze ervaring, de meeste genen opbrengst RT-PCR producten uit lymfoblastoïde cellijnen, 2) veranderde eiwit expressie niveaus te onderzoeken door middel van kwantitatieve Western blot analyse van eiwitten uittreksels uit de lymfoblastoïde cellijnen en 3) verder te testen de mutatie / gen op functioneel niveau in dier (c elegans, zebravis) en cellijn-modellen, zoals eerder gedaan door onze groep (ex: 5,6). </li></ol> 6. Representatieve resultaten: Naar aanleiding van dit protocol, waren we in staat om nieuwe genen voor schizofrenie en autisme te identificeren. Een voorbeeld is onze recent SHANK3 ontdekking van genen (figuur 2). Twee verschillende de novo mutaties in SHANK3 gen, een nonsense mutatie gevonden in drie betrokken broer en een missense mutatie in een betrokken vrouw. <img src="/files/ftp_upload/2534/2534fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. (A) Scheiding van de R1117X nonsense mutatie in drie betrokken broers van de familie PED 419. De proband wordt aangegeven door de pijl. (B) Scheiding van de R536W missense mutatie in de proband, maar niet haar niet-getroffen broer in PED 56.

<ol><li>Bassett, A. S., Bury, A., Hodgkinson, K. A., Honer, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproductive+fitness+in+familial+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Schizophr+Res%22%5BJournal%5D)">Reproductive fitness in familial schizophrenia.</a> Schizophr Res. 21, 151-160 (1996).</li>
<li>Jablensky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia%3A+manifestations%2C+incidence+and+course+in+different+cultures.+A+World+Health+Organization+ten-country+study%5BTitle%5D)+AND+%22Psychol+Med+Monogr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia: manifestations, incidence and course in different cultures. A World Health Organization ten-country study.</a> Psychol Med Monogr. , Suppl 20. 1-97 (1992).</li>
<li>Malaspina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schizophrenia+risk+and+paternal+age%3A+a+potential+role+for+de+novo+mutations+in+schizophrenia+vulnerability+genes%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Spectr%22%5BJournal%5D)">Schizophrenia risk and paternal age: a potential role for de novo mutations in schizophrenia vulnerability genes.</a> CNS Spectr. 7, 26-29 (2002).</li>
<li>DeLisi, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+scan+for+linkage+to+chromosomal+regions+in+382+sibling+pairs+with+schizophrenia+or+schizoaffective+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">A genome-wide scan for linkage to chromosomal regions in 382 sibling pairs with schizophrenia or schizoaffective disorder.</a> Am J Psychiatry. 159, 803-812 (2002).</li>
<li>Gauthier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+SHANK3+Mutations+in+Patients+Ascertained+for+Schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">De Novo SHANK3 Mutations in Patients Ascertained for Schizophrenia.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Piton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+calcium-related+gene+IL1RAPL1+are+associated+with+autism%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the calcium-related gene IL1RAPL1 are associated with autism.</a> Hum Mol Genet. 17, 3965-3974 (2008).</li>
<li>Krawczak, M., Ball, E. V., Cooper, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neighboring-nucleotide+effects+on+the+rates+of+germ-line+single-base-pair+substitution+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Neighboring-nucleotide effects on the rates of germ-line single-base-pair substitution in human genes.</a> Am J Hum Genet. 63, 474-488 (1998).</li>
</ol>

De procedure hier beschreven beoogt de identificatie van specifieke gemeenschappelijke ziekten die waarschijnlijk leiden, voor een deel, van de novo mutaties, en om deze hypothese te bewijzen. De novo mutaties zijn een gevestigde mechanisme voor de ontwikkeling van een aantal ziekten, zoals bijvoorbeeld de erfelijke kanker syndromen, maar is slecht onderzocht in voorkomende ziekten. Dit voor een deel het gevolg van de technische uitdagingen die betrokken zijn bij de identificatie van de novo mutaties, die de opeenvolging van grote hoeveelheden DNA, waarin alleen sprake is vereist zeer kort rendabel met de komst van de Next Generation Sequencing. Daarnaast is de de novo mutatie snelheid in de mens was, tot voor kort, slechts een schatting. Pas zeer recent zijn er meldingen geweest direct het bepalen van de mutatie snelheid bij de mens. Voorafgaand aan deze metingen, was het moeilijk om de steekproefomvang die nodig is voor dit soort onderzoek te voorspellen en om te bepalen of de waargenomen de novo mutatie snelheid is groter dan de baseline. Sequencing kandidaat-genen versus hele genoom? Aangezien het merendeel van de gemelde ziekte mutaties zijn missense / nonsense mutaties en splice site mutaties (volgens HGMD web site) onze screening strategie zou identificeren meer dan 68% van de bekende mutaties. Er is ook een duidelijke relatie tussen de ernst van aminozuur vervanging en de kans op een klinische fenotype. In vergelijking met een conservatieve aminozuursubstitutie, een onzin verandering is 9,0 keer meer kans op klinisch presenteren 7. Dus op dit moment sequencing kandidaat-genen is de meest kosteneffectieve strategie. Het succes van de geschetste procedure is afhankelijk van verschillende kritische stappen, die staan ​​beschreven in detail en geïllustreerd met behulp van twee voorbeelden, autisme en schizofrenie. Er zijn vele valkuilen die moeten worden vermeden, zoals welke ziekte te selecteren, die patiënten te screenen, bron van DNA, en details over hoe ze efficiënt identificeren van de de novo mutaties. Wij bieden een methode om de meest efficiënte wijze het bepalen van de fractie van de gevallen van een ziekte die het gevolg is van een dergelijke spontane mutaties.

een strategie om de novo mutaties leg in voorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie

A Strategy to Identify de Novo Mutations in Common Disorders such as Autism and Schizophrenia

Er zijn verschillende lijnen van bewijs van de rol van de novo mutaties als een mechanisme voor veel voorkomende aandoeningen, zoals autisme en schizofrenie. Ten eerste, de de novo mutatie snelheid in de mens is relatief hoog, zodat nieuwe mutaties worden gegenereerd op een hoge frequentie in de populatie. Echter, de novo mutaties niet gemeld in de meest voorkomende ziekten. Mutaties in genen die leiden tot ernstige ziekten waarbij er een sterke negatieve selectie tegen het fenotype, zoals de letaliteit in de embryonale fase of verminderde reproductieve fitness, zullen niet worden doorgegeven aan meerdere gezinsleden, en zal daarom niet worden gedetecteerd door de koppeling gen in kaart brengen of vereniging studies. De waarneming van zeer hoge concordantie in eeneiige tweelingen en een zeer lage concordantie in twee-eiige tweelingen ook sterk ondersteunt de hypothese dat een belangrijk deel van de gevallen kan het gevolg zijn van nieuwe mutaties. Dat is het geval voor ziekten zoals autisme en schizofrenie. Ten tweede, ondanks de verlaging van de reproductieve fitness 1 en uiterst variabel omgevingsfactoren, is de incidentie van sommige ziekten blijven wereldwijd op een relatief hoge en constante snelheid. Dit is het geval voor autisme en schizofrenie, met een incidentie van ongeveer 1% wereldwijd. Mutatie-belasting kan worden gezien als een balans tussen de selectie voor of tegen een schadelijke mutatie en de productie ervan door de novo mutatie. Lagere tarieven van de voortplanting vormen een negatieve selectie factor die het aantal mutante allelen moet verminderen in de populatie, wat uiteindelijk leidt tot een verminderde prevalentie van de ziekte. Deze selectieve druk de neiging om van verschillende intensiteit in verschillende omgevingen. Toch hebben deze ernstige psychische stoornissen gehandhaafd op een constant relatief hoge prevalentie in de wereldwijde populatie over een brede waaier van culturen en landen, ondanks een sterke negatieve selectie tegen hen twee. Dit is niet wat men zou kunnen voorspellen bij ziekten met een verminderde reproductieve fitness, tenzij er een hoog tempo nieuwe mutatie. Ten slotte is de effecten van de vaderlijke leeftijd: er is een significant verhoogd risico van de ziekte met toenemende vaderlijke leeftijd, die zou kunnen voortvloeien uit de leeftijd gerelateerde toename in vaderlijke de novo mutaties. Dit is het geval voor autisme en schizofrenie 3. De man-naar-vrouw-verhouding van mutaties wordt geschat op ongeveer 4-6:1, vermoedelijk als gevolg van een hoger aantal kiem-celdelingen met de leeftijd bij mannen. Daarom zou een voorspellen dat de novo mutaties zouden vaker komen van mannen, vooral oudere mannen 4. Een hoog percentage van nieuwe mutaties kan verklaren ten dele waarom genetische studies tot nu toe niet in geslaagd om vele genen die predisponeren voor complexen ziekten genen, zoals autisme en schizofrenie te identificeren, en waarom ziekten zijn aangemerkt voor slechts 3% van de genen in het menselijk genoom . Identificatie voor de novo mutaties als oorzaak van een ziekte vraagt ​​om een doelgerichte moleculaire benadering, die het bestuderen van de ouders en betrokken onderwerpen omvat. Het proces om te bepalen of de genetische basis van een ziekte kan leiden tot een deel van de novo mutaties en de moleculaire benadering om vast te stellen deze koppeling zal worden geïllustreerd met behulp van autisme en schizofrenie als voorbeelden.

Moleculair genetische strategie voor het vinden van de novo mutaties veroorzaken veel voorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie.

Een strategie om de Novo Mutaties Leg in voorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie

Er zijn verschillende bewijslijnen die de rol van de novo-mutaties ondersteunen als mechanisme voor veelvoorkomende stoornissen, zoals autisme en schizofrenie. Ten eerste, ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de novo mutaties bij veelvoorkomende genetische aandoeningen te kunnen identificeren. Zodra een ziekte is geïdentificeerd die overeenkomt met de hypothese van de novo mutaties, worden kritische criteria toegepast voor de selectie van patiëntencasussen waarin gescand wordt naar de novo mutaties. Vervolgens wordt hoogwaardige sequencing met een lage doorvoer, of whole exome sequencing, gebruikt om dergelijke mutaties met behulp van deze strategie te identificeren.De novo-mutaties in het Shank 3-gen werden aangetroffen bij proefpersonen met schizofrenie. Hoewel deze methode inzicht kan verschaffen in de genetica van schizofrenie en autisme, kan deze ook worden gebruikt om andere veelvoorkomende aandoeningen te bestuderen, zoals mentale retardatie.Niet alle ziekten passen in het profiel van een de Novo-ziekte. Daarom zijn dit, voordat het protocol wordt beschreven, de essentiële criteria waaraan een ziekte moet voldoen om in aanmerking te komen als een Novo-mutatieziekte. Patiënten met de ziekte vertonen een vermindering in fitness.De ziekte komt frequent voor in zeer uiteenlopende omgevingen. De ziekte wordt soms geassocieerd met een hogere vaderlijke leeftijd. Klassieke linkage- en associatiestudies slagen er niet in om een significant deel van de erfelijkheid van de ziekte te verklaren.Ten slotte moeten gegevens over de concordantie bij tweelingen een de novo-model ondersteunen. Pas vervolgens criteria toe om monsters te selecteren met een hoge waarschijnlijkheid van een de novo-mutatie. De novo-mutaties correleren met een vroege onset, ernstige fenotypes, niet-aangedane ouders en oudere vaders zonder ziekteverschijnselen.De beschikbaarheid van DNA kan de monsterselectie beperken. Tenzij monsters beschikbaar zijn van zowel de patiënt als de ouders van de patiënt, kan overdracht niet worden uitgesloten. Daarnaast zijn ook aanvullende aangedane cohorten en gezonde proefpersonen nodig voor de validatie van een geïdentificeerd kandidaatgen.Wanneer een voldoende grote steekproefomvang van kandidaten en controles is verzameld, kan men overgaan tot de analyse om de beste kandidaatgenen te selecteren. Deze selectie is gebaseerd op een scoringssysteem. Bijvoorbeeld, deze set criteria kan worden gebruikt voor het scoren van genen die geassocieerd zijn met neurocognitieve ziekten.Neurologische aandoeningen zoals amyotrofische laterale sclerose zouden bijvoorbeeld zeer andere criteria gebruiken. Deze omvatten bewijs voor synaptische implicatie, bewijs voor synaptische lokalisatie, weefselexpressie, patroongegevens, diermodellen, cognitiegegevens en argumenten uit genetische analyse en betrokkenheid. Na het toepassen van deze criteria kunnen veel genen uit de studie worden gefilterd ten gunste van betere kandidaten.Na de sequencing wordt voor de kandidaatgenen een combinatie van twee of meer tools voor sequentieanalyse toegepast, omdat deze gewoonlijk op verschillende manieren werken. Zo is de fout-positieve mutatiesnelheid voor SNP's, zoals berekend door de polys scan-software en weergegeven in deze grafiek, hoger dan wat berekend wordt door de poly Fred-software. Polys scan vertoont daarnaast een lagere mutatiesnelheid voor indels dan poly Fred.Als laatste stap voor elke nieuwe exonische variant worden technische artefacten geëlimineerd door bevestiging via PCR en hersequencing. De regio van belang in DNA geëxtraheerd uit bloedmonsters van de patiënt en beide ouders; het uitvoeren van deze stap op bloed-DNA is belangrijk, omdat sommige mutaties het gevolg kunnen zijn van artefacten veroorzaakt door de deling van gecultiveerde lymfoblasten-cellijnen. Een krachtig alternatief voor het sequensen van geselecteerde kandidaatgenen is het gebruik van high-throughput sequencing om de coderende regio's van 16.000 genen te sequensen.Er zijn inmiddels kits van diverse commerciële bedrijven beschikbaar om monsters voor whole exome sequencing voor te bereiden. Wanneer deze sequenties naar het laboratorium worden teruggestuurd, kan er worden gekozen uit verschillende bio-informatica tools voor de detectie en genotypering van genomische variatie. Selecteer nu, voordat u mutaties binnen het gehele exoom prioriteert, varianten uit gerangschikte kandidaatgenen zoals eerder is uitgelegd.Voor alle varianten moet voor elke variant prioriteit worden bepaald op basis van twee criteria. Ten eerste moet de variant uniek zijn en noch bij de ouders, noch in openbare s- en p-databases voorkomen. Ten tweede wordt voorspeld dat de varianten de genfunctie beïnvloeden op basis van hun locatie in de sequentie, door deze ofwel te trunceren of te wijzigen.De coating. Programma's zoals PolyPhen, SIFT en Panther kunnen deze voorspellingen allemaal maken om andere causatieve mutaties te identificeren en vast te stellen dat de geïdentificeerde mutaties niet aanwezig zijn bij gezonde individuen; hersequenceer het gehele gen in aanvullende patiëntencasussen en in controles. Elk gen dat ten minste één de novo mutatie bevat waarvan wordt voorspeld dat deze deletrieus is, moet verder worden gevalideerd. Bevestigde varianten kunnen functioneel worden gekarakteriseerd door mRNA- en/of eiwitanalyses uit te voeren op cellijnen of diermodellen die de mutaties dragen.Deze functionele analyses kunnen worden uitgevoerd op cellijnen of diermodellen met behulp van de hoogwaardige, low-throughput canida-genbenadering. In patiënten met schizofrenie werd een gen met twee verschillende de novo mutaties gevonden. Eén nonsensmutatie werd aangetroffen bij drie getroffen broers.Bij deze familie leidde de mutatie tot een prematuur stopcodon op positie 117 van het gen shank3. Bij een andere familie werd een missense-mutatie in hetzelfde gen aangetroffen bij een aangedane vrouw. Deze mutatie verandert arginine in tryptofaan, een zeer verschillend aminozuur op codon 536.Na het bekijken van deze video en het toepassen van de beschreven methoden, zou u in staat moeten zijn om de door u bestudeerde ziekte te evalueren om vast te stellen of de Novo-mutaties een rol spelen.

a-strategy-to-identify-de-novo-mutations-common-disorders-such-as

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Array CGH voor de detectie van genomische kopij varianten heeft G-gestreepte karyotype analyse vervangen. Dit artikel beschrijft de technologie en de toepassing ervan in een diagnostische dienst laboratorium.

Array comparative genomic hybridisatie (Array CGH) voor detectie van genomische kopij Varianten

Nodulair heterotopia van de Periventricular (PNH) is de meest voorkomende vorm van misvorming van corticale ontwikkeling (MCD) in volwassenheid maar haar genetische basis blijft onbekend in meest sporadische gevallen. Onlangs hebben we een strategie nieuwe kandidaat om genen te identificeren voor MCDs en direct bevestigen hun oorzakelijke rol in vivo.

Een nieuwe strategie combinatie matrix-CGH, geheel-exome Sequencing en In Utero Electroporation bij knaagdieren ter identificatie van de oorzakelijke genen voor hersenen misvormingen

We presenteren een strategisch plan en protocol voor het identificeren van niet-coderende genetische varianten die de binding van transcriptiefactoren (TF) aan DNA beïnvloeden. Er wordt een gedetailleerd experimenteel protocol gegeven voor elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay (EMSA) en DNA-affiniteitsprecipitatie-assay (DAPA) analyse van genotype-afhankelijke TF DNA-binding.

Screening voor Functionele niet-coderende genetische varianten Met behulp van Electroforetische Mobility Shift Assay (EMSA) en DNA-affiniteit Neerslag Assay (DAPA)

Neurologische processen zoals proliferatie, migratie en neurite uitvloeisel zijn vaak verstoord in neuropsychiatrische ziekten. Dus presenteren we protocollen om te snel en reproducibly beoordelen deze neurologische processen in menselijke iPSC afkomstige NPC's. Deze protocollen toestaan ook de beoordeling van de gevolgen van relevante factoren die de groei en therapeutics NPC ontwikkelingssamenwerking.

Snelle detectie van neurologische fenotypen in menselijke neurale voorlopercellen (NPC)

Volgende-generatie rangschikken (NGS) is een krachtig hulpmiddel voor genomische karakterisering die wordt beperkt door het hoge foutenpercentage van het platform (~0.5–2.0%). Wij beschrijven onze methoden van fout-gecorrigeerde sequentie die ons toelaten te ondervangen van het NGS foutenpercentage en mutaties op variant allel breuken zo zeldzaam als 0,0001 detecteren.

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Autisme Spectrum Stoornis (ASS) wordt geassocieerd met verminderd sociaal en communicatief gedrag en het ontstaan van repetitief gedrag. Voor het bestuderen van de onderlinge relatie tussen ASS-genen en gedragsstoornissen in het Drosophila-model , worden in dit artikel vijf gedragsparadigma's beschreven voor het bepalen van sociale afstand, agressie, verkering, verzorging en gewenningsgedrag.

Paradigma's voor gedragsbeoordeling in het Drosophila-model van autismespectrumstoornis

Knaagdiermodellen zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bestuderen van kerngedrag dat verband houdt met autismespectrumstoornis (ASS). In dit artikel gaan we dieper in op twee gedragstests voor het modelleren van de kernkenmerken van ASS bij muizen: zelfverzorging, die repetitief gedrag beoordeelt, en de driekamertest voor sociale interactie, die sociale beperkingen documenteert.

Strategieën voor het beoordelen van autistisch-achtig gedrag bij muizen

Dit handschrift bevat een eenvoudige, maar krachtige, in vitro methode voor het evalueren van de gladde spieren contractiliteit in reactie op farmacologische middelen of zenuwstimulatie. Belangrijkste toepassingen zijn het testen van geneesmiddelen en begrip weefsel fysiologie, farmacologie en pathologie.

Gladde blaasspier Strip Contractiliteit als een methode om te evalueren Lower Urinary Tract Farmacologie

Retinale beeldanalyse is een onopvallende procedure voor het visualiseren van de microcirculatie. De gevolgen van hart-en vaatziekten risicofactoren kunnen leiden tot veranderingen van het netvlies kalibers vaartuig. De procedures voor fundus foto en stappen te nemen voor het berekenen van het vaartuig kalibers worden beschreven.

Fundus fotografie als een handig hulpmiddel om microvasculaire Reacties op hart-en vaatziekten Risicofactoren in epidemiologische studies Studie

Het huidige werk illustreert het gemak van het gebruik van sublinguale immunotherapie om de aangeboren immuunrespons in de longen te versterken en bescherming te bieden tegen acute pneumokokkenpneumonie bij muizen.

Sublinguale immunotherapie als een alternatief voor bescherming tegen acute luchtwegeninfecties Induce

Ontdek een strategie om de novo mutaties te identificeren in veelvoorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie met behulp van sequencing en bio-informatica. Deze methode helpt onderzoekers bij het valideren van kandidaatgenen.

Een strategie om de Novo Mutaties Leg in voorkomende aandoeningen zoals autisme en schizofrenie

Meer video's verkennen