Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen

Deze procedure maakt gebruik van de Viro chip, een pan-virale microarray-assay om klinische monsters te analyseren op zowel bekende als onbekende virussen. Eerst worden nucleïnezuren uit de klinische monsters geëxtraheerd. Vervolgens wordt het geëxtraheerde RNA teruggetranscribeerd met behulp van random primers.

De synthese van de tweede streng cDNA wordt uitgevoerd en de cDNA-bibliotheek wordt geamplificeerd met random PCR. Vervolgens wordt het geamplificeerde cDNA gelabeld met fluorescerende kleurstoffen en gehybridiseerd op een virale chip-microarray. De laatste stap is het scannen en analyseren van de microarray.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de aanwezigheid of afwezigheid van een virus of meerdere virussen aantonen via analyse van de chip-microarray. Breed-spectrum detectiemethoden, zoals een virale chip-microarray, zijn noodzakelijk in de diagnostische microbiologie omdat veelvoorkomende klinische syndromen, zoals pneumonie, niet specifiek zijn voor één individueel pathogeen, en vanwege de voortdurende dreiging van nieuwe virale pathogenen, zoals het SARS-coronavirus en het nieuwe H1N1-influenzavirus van 2009. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de diagnostische microbiologie, zoals welk percentage van de niet-gediagnosticeerde infecties in een klinische setting kan worden veroorzaakt door tot nu toe niet geïdentificeerde nieuwe virussen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een betere diagnose van acute klinische aandoeningen in het ziekenhuis, omdat we gelijktijdig testen op honderden tot duizenden potentiële pathogenen.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode in 2002, toen we besloten de onlangs ontwikkelde microarray-technologie, gepionierd in het laboratorium van Dr. Joseph DeRisi aan de UCSF, toe te passen op de detectie van virussen. Onze eerste praktijktest was het gebruik van de virale chip om in 2003 een nieuw coronavirus te identificeren dat verantwoordelijk was voor SARS. Om de procedure van begin tot eind te demonstreren, zal een technicus uit mijn laboratorium laten zien hoe de virale chip-assay wordt gebruikt op een neusswabmonster van een kind om de oorzaak van haar acute respiratoire aandoening te diagnosticeren. Nasopharyngeale swabmonsters worden verzameld in steriele containers met viraal transportmedium en bevroren bewaard in een vriezer van -80 °C.

Laat de buis met het monster in een biosafety-kast ontdooien en roer de wattenstaaf kort in het medium voordat u de wattenstaaf weggooit in een container voor biologisch gevaarlijk afval. Pipetteer vervolgens 200 µL van het monster in een buisje van 1,5 mL. Filter het monster door een spinfilter van 0,22 micron om virale deeltjes te zuiveren en vang dit op in een nieuw buisje van 1,5 mL.

Gebruik vervolgens de Turbo DNA-kit van Ambien volgens de instructies van de fabrikant om gastheer-genomisch DNA af te breken en het ingekapselde beschermde virale nucleïnezuur te zuiveren. Voer daarna RNA-extractie uit met de XMO ZR virale RNA-extractiekit of de Qiagen ultrasound viruskit volgens de instructies van de fabrikant. Meet de concentratie van het geëxtraheerde RNA met een NanoDrop nucleïnezuur-spectrofotometer.

De RNA-concentratie is bij voorkeur ten minste 10 ng/µL, maar dit zal per monster variëren bij gebruik van een dunwandige buis van 200 µL. Voeg één µL primer A met een concentratie van 40 pmol/µL toe aan vier µL geëxtraheerd RNA. Verwarm het monster gedurende vijf minuten op 65 °C in een thermocycler en laat de buis vervolgens vijf minuten afkoelen tot kamertemperatuur.

Voeg vervolgens vijf µL van een mastermix toe aan een thermocycler, bestaande uit twee µL 5× RT-buffer, één µL 12,5 mM dNTP, één µL water, 0,5 µL 0,1 M DTT en 0,5 µL reverse transcriptase. Incubeer de buis 60 minuten bij 42 °C. Verhit het monster vervolgens twee minuten bij 94 °C.

Om de reverse transcriptase-reactie te stoppen, koelt u af naar 10 °C gedurende twee minuten en centrifugeert u kort gedurende vijf seconden. Voeg vervolgens vijf µL quease-mengsel toe, bestaande uit één µL vijfvoudige quease-buffer, 3,8 µL water en 0,15 µL quease voor de synthese van de tweede streng. Verwarm de thermocycler geleidelijk van 10 °C naar 37 °C gedurende acht minuten.

Houd 8 minuten op 37 °C. Verhit vervolgens 2 minuten tot 94 °C om het enzym te inactiveren en koel op dit punt af tot 10 °C. Indien gewenst kan het monster met 15 µL cDNA worden bewaard bij -20 °C.

Voeg eerst vijf µL CD NA-monster toe aan 45 µL van een mastermix bestaande uit vijf µL 10× PCR-buffer, één µL 12,5 mM dNTP, één µL 100 pmol/µL primer B, één µL cleantech LA en 37 µL water. Voer vervolgens het PCR-protocol als volgt uit: 94 °C gedurende twee minuten, gevolgd door 25 cycli van 94 °C gedurende 30 seconden, 50 °C gedurende 45 seconden en 72 °C gedurende één minuut.

Vervolgens volgt een annealing-stap van 72 °C gedurende vijf minuten, gevolgd door een hold op 10 °C na de PCR. Controleer het PCR-product op een 1,5% agarose-elektroforesegel. Er moet een smear zichtbaar zijn van ongeveer 200 tot 1000 baseparen.

Om AAD DNTP in te bouwen, voegt u vijf µL viraal PCR-product toe aan 45 µL van een mastermix bestaande uit vijf µL 10× PCR-buffer, één µL 12,5 mM A-A-D-N-T-P, één µL 100 p van meerdere µL primer B, één µL ClinTech LA en 37 µL water. Voer het PCR-protocol als volgt uit: 94 °C gedurende twee minuten, 15 cycli van 94 °C gedurende 30 seconden en 50 °C gedurende 45 seconden.

72 °C gedurende één minuut, gevolgd door een annealingsstap van 72 °C gedurende vijf minuten en vasthouden op 10 °C. Reinig vervolgens het nieuwe PCR-product met de DNA Clean & Concentrator 3-kit volgens de instructies van de fabrikant en los dit op in 10 µL elutiebuffer. Voeg één µL 1 M bicarbonaat en één µL si3 toe aan de 10 µL PCR-product en incubeer dit gedurende één uur in het donker.

Reinig vervolgens opnieuw het S-gelabelde monster met de DNA Clean and Concentrator 5-kit en elueer in 12 µL elutiebuffer. Gebruik 1,5 µL van het monster om de cDNA-concentratie en de hoeveelheid ingebouwde kleurstof te controleren met een NanoDrop-spectrofotometer in een PCR-stripbuis met 1 µL 25× fragmentatiebuffer, 5 µL 5× blokkeringsbuffer, 9,5 µL of de benodigde hoeveelheid voor een genormaliseerde uiteindelijke concentratie van 10 pM of pmol/µL van het SI3-gelabelde monster en water tot een totaalvolume van 25 µL. Voeg vervolgens 25 µL 2× GX-hybridisatiebuffer toe en centrifugeer kort om luchtbellen te verwijderen.

Plaats een nieuwe gasket-dia in de hybridisatiekamer. Breng 40 µL van het monster aan op de gasket-dia. Plaats vervolgens de Agilent geprinte virale array met de zijde die is gemarkeerd met Agilent naar beneden op de gasket-dia en draai de schroef stevig vast.

Plaats de hybridisatiekamer in een oven van 65 °C en hybridiseer gedurende de nacht met een langzame rotatie van 10 rotaties per minuut om de arrays te wassen. Verwarm eerst buffer twee voor tot 37 °C tijdens het opwarmen. Vul een plastic container van 500 ml met ongeveer 250 ml buffer één.

Verwijder de array uit de hybridisatiekamer, dompel de array onder en scheid deze van de gasket-dia. Verplaats de array naar de schone container en was deze gedurende één minuut in buffer één. Gebruik vervolgens een aparte plastic container van 500 milliliter.

Was de array gedurende één minuut in voorverwarmde buffer twee. Verwijder de array na het wassen langzaam uit buffer twee, waarbij u er zorgvuldig op let dat er geen luchtbellen ontstaan.

Gebruik een kimwipe om overtollig vocht weg te trekken, waarbij u er zorgvuldig op let dat u de actieve zijde van de array niet rechtstreeks aanraakt. Plaats tot slot de slide met de Agilent-zijde naar boven in de slidehouder en voer deze in de array-scanner in. In deze procedure gebruiken we een Agilent two micron DNA-microarray-scanner.

Scan de gelabelde SI three array bij vijf micron of twee micron volgens het standaard scanprotocol van het instrument. Analyseer virale chipp microarrays via clusteranalyse of het automatische RO chipp analyseprogramma e unpredic. Met behulp van de Viro Chipp microarray kan het nieuwe influenza H one N one virus in 2009 gemakkelijk worden gedetecteerd in het neusswabmonster van een kind met een influenza-achtige ziekte.

Daarnaast hebben we aangetoond dat de virale chip niet alleen in staat is om respiratoire virussen te identificeren, maar ook een breed scala aan virussen uit diverse verschillende weefsels en lichaamsvloeistoffen. Enkele voorbeelden van virusdetectie in volbloed en serum met behulp van de vichi, zoals hier getoond. Dit zijn resultaten die overeenkomen met de viro chip-microarray van bloedmonsters, zijnde volbloed of serum afgenomen van vier patiënten; voor elk monster worden de twee beste virusvoorspellingen getoond, waarbij de beste virusvoorspelling de laagste P-waarde heeft.

Bijvoorbeeld, in het lichtblauw gemarkeerde monster is de belangrijkste voorspelling denguevirus type 1. Hoewel de tweede voorspelling denguevirus type 2 is, werd het feitelijke virus in dat volbloedmonster inderdaad bevestigd als denguevirus type 1, in overeenstemming met de dict-resultaten. Een andere toepassing van de viro chip is de ontdekking van nieuwe pathogenen.

Enkele voorbeelden zijn de ontdekkingen van sars-coronavirussen, X-M-R-V-A, het OME-retrovirus dat gelinkt is aan prostaatkanker en chronisch vermoeidheidssyndroom bij mensen, en HTCV, een nieuw menselijk cardiovirus dat geassocieerd wordt met respiratoire infecties en diarree bij kinderen. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in 12 uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle benodigde apparatuur en reagentia beschikbaar zijn volgens deze procedure.

Andere methoden, zoals specifieke virale PCR-amplificatie en deep sequencing, kunnen worden uitgevoerd om ongebruikelijke viral chip-hybridisatiepatronen of viral chip-resultaten te bevestigen en op te volgen die na de ontwikkeling wijzen op de aanwezigheid van een nieuw virus. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de oncologie om de associatie van nieuwe virussen met kanker te onderzoeken, in de velden van bioverdediging en klinische microbiologie om gecondenseerde micro-gebaseerde assays te ontwikkelen voor snelle pathogeendiagnostiek, en in het veld van de virologie voor de karakterisering van nieuwe virussen en hun associatie met ziekten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u alle stappen van de viral chip microarray-assay moet uitvoeren, een breedspectrum surveillancetest om virale pathogenen in klinische monsters te detecteren, vanaf de extractie van nucleïnezuren uit klinische monsters tot aan de microarray-hybridisatie en analyse.

Vergeet niet dat het werken met klinische monsters als biologisch gevaarlijk wordt beschouwd en dat de extractie van nucleïnezuren moet worden uitgevoerd in laboratoria met een biosafety-niveau twee of hoger.