Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen

Deze procedure maakt gebruik van de Viro chip, een pan virale microarray test om klinische monsters te analyseren op zowel bekende als onbekende virussen. Eerst worden nucleïnezuren uit klinische monsters geëxtraheerd. Vervolgens wordt het geëxtraheerde RNA omgekeerd getranscriseerd met behulp van willekeurige primers.

Synthese van de tweede streng CD NA wordt uitgevoerd en de CD NA bibliotheek wordt geamplificeerd met willekeurige PCR. Vervolgens wordt het geamplificeerde cd NA gelabeld met fluorescerende kleurstoffen en gehybridiseerd naar een virale chip microarray. De laatste stap is om de microarray te scannen en te analyseren.

Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de aanwezigheid of afwezigheid van een virus of meerdere virussen tonen door analyse van de chip microarray. Breedspectrumdetectiemethoden zoals een virale chip microarray zijn nodig in diagnostische microbiologie omdat veelvoorkomende klinische syndromen zoals pneumonie niet specifiek zijn voor een individueel pathogeen, en vanwege de voortdurende dreiging van nieuwe virale pathogeen zoals het SARS Coronavirus en 2009 nieuwe H een N een influenza virus. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen op het gebied van diagnostische microbiologie te beantwoorden, zoals welk percentage van niet-gediagnosticeerde infecties in de klinische omgeving mogelijk wordt veroorzaakt door nog niet geïdentificeerde nieuwe virussen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een betere diagnose van acute klinische ziekten in het ziekenhuis omdat we tegelijkertijd testen op honderden tot duizenden potentiële pathogenen.

We hadden het idee voor deze methode voor het eerst in 2002 toen we besloten om de nieuw ontwikkelde technologie van microarrays, gepionierd in het laboratorium van Dr. Joseph DeRisi aan UCSF, toe te passen op de detectie van virussen. Onze eerste echte wereld testcase was het gebruik van de virale chip om een nieuw coronavirus verantwoordelijk voor SARS in 2003 te identificeren, die de procedure van begin tot einde zal demonstreren, zal een technicus uit mijn laboratorium de gebruik van de virale chip test op een neusborstelmonster van een kind demonstreren om de oorzaak van haar acute respiratoire aandoening te diagnosticeren. Neusfaryngeale borstelmonsters worden verzameld in steriele containers met virustransport, vloeibaar medium, en worden bevroren bewaard in een min 80 graden Celsius vriezer.

Laat in een bioveiligheidskap de buis met het monster ontdooien en roer de borstel kort in het medium voordat deze in een biogevaarlijk afvalbak wordt weggegooid. Verdeel vervolgens 200 microliter van het monster in een buis van 1,5 milliliter. Laat het monster door een 0,22 micron spinfilter gaan om voor virale deeltjes te zuiveren en in een nieuwe buis van 1,5 milliliter.

Gebruik vervolgens de Turbo DNA's kit van Ambien volgens de instructies van de fabrikant om genomisch DNA van de gastheer af te breken en voor beschermde ingekapselde virale nucleïnezuur te zuiveren. Volg dit met RNA extractie, met behulp van de XMO ZR virale RNA extractie kit of Qiagen ultrasoon virus kit volgens de instructies van de fabrikant. Meet de concentratie van het geëxtraheerde RNA met behulp van een NanoDrop nucleïnezuur spectrofotometer.

De RNA concentratie is bij voorkeur minimaal 10 nanogram per microliter, maar kan variëren van monster tot monster met behulp van een dunne muur 200 microliter buis. Voeg één microliter primer A toe met een concentratie van 40 PICA mol per microliter aan vier microliter geëxtraheerd RNA. Verhit het monster gedurende vijf minuten tot 65 graden Celsius in een thermocycler, en laat de buis afkoelen tot kamertemperatuur gedurende vijf minuten.

Voeg vervolgens vijf microliter van een master mix toe die bestaat uit twee microliter vijf keer RT buffer, één microliter 12,5 millimolair, DNTP één microliter water 0,5 microliter, 0,1 molair DTT en 0,5 microliters superscript drie, reverse transcriptase in een thermocycler. Incubeer de buis gedurende 60 minuten bij 42 graden Celsius. Verhit vervolgens het monster gedurende twee minuten tot 94 graden Celsius.

Om de reverse transcriptase reactie te stoppen, breng de temperatuur terug naar 10 graden Celsius gedurende twee minuten en centrifugeer gedurende vijf seconden. Voeg vervolgens vijf microliter van quease mix toe die bestaat uit één microliter vijf keer quease buffer, 3,8 microliter water en 0,15 microliter quease de tweede streng synthese. Verhoog de temperatuur van de thermocycler gedurende acht minuten van 10 graden Celsius naar 37 graden Celsius.

Houd gedurende acht minuten op 37 graden Celsius. Verhit vervolgens gedurende twee minuten tot 94 graden Celsius om de quease te inactiveren en breng de temperatuur terug naar 10 graden Celsius. Indien gewenst, bewaar het monster met 15 microliter CDNA bij min 20 graden Celsius.

Voeg eerst vijf microliter CD NA monster toe aan 45 microliter van een master mix bestaande uit vijf microliter 10 keer PCR buffer, één microliter 12,5 millimolair, DNTP één microliter 100 pomo per microliter primer, B één microliter cleantech LA en 37 microliter water. Voer vervolgens het PCR protocol uit zoals volgt, 94 graden Celsius gedurende twee minuten, gevolgd door 25 cycli van 94 graden Celsius gedurende 30 seconden. 50 graden Celsius gedurende 45 seconden en 72 graden Celsius gedurende één minuut.

Vervolgens een knielende stap van 72 graden Celsius gedurende vijf minuten, gevolgd door een houden bij 10 graden Celsius na PCR. Controleer het PCR product en een 1,5% AOSE elektroforese gel. Er moet een vlek worden gevisualiseerd van ongeveer 200 tot 1000 base pairs.

Voeg vijf microliter van virale PCR product toe aan 45 microliter van een master mix bestaande uit vijf microliter 10 keer PCR buffer, één microliter 12,5 millimolair, A-A-D-N-T-P één microliter 100 p van multiple microliter primer, B één microliter ClinTech LA en 37 microliter water. Voer het PCR protocol uit zoals volgt, 94 graden Celsius gedurende twee minuten, 15 cycli van 94 graden Celsius gedurende 30 seconden. 50 graden Celsius gedurende 45 seconden.

72 graden Celsius gedurende één minuut en een knielende stap van 72 graden Celsius gedurende vijf minuten en houd bij 10 graden Celsius. Reinig vervolgens het nieuwe PCR product met de DNA clean and concentrator drie kit volgens de instructies van de