Name: Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 45 s
Description: Leer de Virochip-microarray-assay voor het detecteren van virale pathogenen in klinische stalen. Deze methode identificeert zowel bekende als nieuwe virussen via sequentiehomologie en verbetert de diagnostische nauwkeurigheid.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken David Wang, Anatoly Urisman, Amy Kistler, Kael Fischer, Patrick Tang, en Alexander Greninger voor de initiële ontwikkeling en optimalisatie van de Virochip protocol. Dit werk wordt ondersteund door een NIH K08 subsidie ​​en Abbott Discovery Award (voor CC) en de Howard Hughes Medical Institute (tot JLD).

De stappen van de Virochip test omvatten (1) nucleïnezuur extractie uit klinische monsters, (2) reverse transcriptie van geëxtraheerde RNA en 2 e-streng cDNA synthese, (3) PCR-amplificatie van willekeurig geprimed cDNA, (3) Cy3 fluorescerende kleurstof incorporatie , (4) hybridisatie van gelabeld materiaal aan de Virochip microarray, en (5) scanning en analyse (figuur 1). Het protocol hieronder demonstreren het gebruik van de Virochip test op een neusuitstrijk monster van een kind met een influenza-achtig ziektebeeld. Primer Sequences Primer Een 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-(N 9) -3 ' Primer B 5'-GTTTCCCAGTCACGATA-3 ' 1. Nucleic Acid Extraction <ol><li> Nucleïnezuur-extractie uit klinische monsters moeten worden uitgevoerd onder Biosafety Level 2 (BSL-2) of hoger voorwaarden, zoals deze monsters zijn mogelijk infectieus. </li><li> De neusuitstrijk monster wordt vervoerd in virale holding medium. Aliquot 200 pi van het monster in een 1,5 ml Eppendorf microcentrifugebuis. </li><li> Optioneel: passeren monster door een 0.22 urn filter (om te zuiveren voor virale deeltjes) </li><li> Optioneel: voorbehandelen monster met DNAse (voor het hosten genomisch DNA af te breken en te zuiveren voor beschermde, encapsidated viraal nucleïnezuur) met behulp van de Turbo DNAse kit (Ambion) volgens de instructies van de fabrikant </li><li> Extraheer het monster met behulp van de Zymo ZR Viral RNA-extractie Kit of Qiagen Ultrasens Virus Kit volgens de instructies van de fabrikant. </li></ol> 2. Reverse transcriptie en 2 e-streng cDNA Synthese ("Round A") <ol><li> Voeg 1 uL 40 pmol / ul Primer A tot en met 4 ul geëxtraheerde RNA. Verwarm tot 65 ° C laten gedurende 5 min in een thermocycler (bijv. GeneAmp PCR System 9700) en daarna afkoelen bij kamertemperatuur x 5 minuten. </li><li> Voeg 5 ul van een master mix die bestaat uit 2 pl 5X RT buffer, 1 ui 12,5 mM dNTP, 1 ui water, 0,5 pi 0,1 M DTT, en 0,5 ul SSIII RT (Invitrogen). Incubeer bij 42 ° C x 60 minuten. </li><li> In een programmeerbare thermocycler, warmte tot 94 ° C x 2 min (af te breken van de reverse transcriptase reactie), afkoelen tot 10 ° C, pols centrifuge, en voeg dan 5 microliter Sequenase mix, bestaande uit 1 ui 5X Sequenase buffer, 3,8 uL water, en 0,15 pi Sequenase (USB Corporation). Voor de 2 e streng synthese, op helling van 10 ° C tot 37 ° C gedurende 8 min, 8 min, vervolgens warmte vasthouden aan 94 ° C x 2 min (tot Sequenase inactiveren) en laat afkoelen tot 10 ° C (houden). </li><li> Optioneel: Rd Een voorbeeld van een cDNA kan worden opgeslagen op dit punt bij -20 ° C. </li></ol> 3. PCR-amplificatie van willekeurige primer CDNA ("Round B") <ol><li> Voeg 5 uL van Rd Een steekproef tot 45 ul van een master mix bestaande uit 5 ul 10X PCR-buffer, 1 ui 12,5 mM dNTP, 1 ui 100 pmol / ul primer B, 1 ui KlenTaq LA (Sigma), en 37 pi water. </li><li> Run PCR-protocol als volgt: 94 ° C, 2 min → (25 cycli van 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( ingedrukt houden) </li><li> Controleer de Rd B monster op een 1,5% agarose elektroforese gel. Een uitstrijkje van ongeveer 200 - 1000 bp moet worden gevisualiseerd (Figuur 2A) </li></ol> 4. Cy3 fluorescerende kleurstof Incorporation <ol><li> Optioneel: een ander monster kan worden gelabeld met de Cy5 fluorescente kleurstof en gehybridiseerd op hetzelfde microarray. </li><li> Op te nemen aa-dNTP, voeg 5 uL van Rd B monster op 45 uL van een master mix bestaande uit 5 uL 10X PCR-buffer, 1 uL 12,5 mM aa-dNTP (Invitrogen), 1 uL 100 pmol / ul primer B, 1, 1 uL KlenTaq LA (Sigma), en 37 uL water. Run PCR-protocol als volgt: 94 ° C, 2 min → (15 cycli van 94 ° C, 30 s / 50 ° C, 45 s / 72 ° C, 1 min) → 72 ° C, 5 min → 10 ° C ( ingedrukt houden) </li><li> Reinig de Rd C monster met het DNA Schoon en Concentrator-5 Kit (Zymo Onderzoek) volgens de instructies van de fabrikant. Elueren in 10 pi. </li><li> Voeg 1 uL van 1M bicarbonaat (Sigma) en 1 uL Cy5 (GE Healthcare) aan de Rd C monster. </li><li> Incubeer x 1 uur in het donker. </li><li> Reinig de Cy3-gelabelde monster met het DNA Schoon en Concentrator-5 Kit (Zymo Onderzoek) volgens de instructies van de fabrikant. Elueren in 12 uL. </li></ol> 5. Hybridisatie aan Virochip Microarray <ol><li> Optioneel: gebruik 1,5 pi tot cDNA concentratie en de hoeveelheid kleurstof opgericht op een Nanodrop spectrofotometer cheque (voor de normalisatie van de monsters) </li><li> In een PCR-strook buis voeg 1 ui 25X fragmentatie buffer, 5 ul 5x blokkerende buffer, 9,5 pi (of het bedrag te normaliseren) van Cy3-gelabeld monster, en water tot een totaal volume van 25 pi (Agilent) </li><li> Voeg 25 ul van 2X Gex hybridisatiebuffer (Agilent). Kort spin down om luchtbellen te verwijderen. </li><li> Belasting 40 pl van het monster op pakking dia. </li><li> Plaats Agilent bedrukte Virochip array (Universiteit van Californieen, San Francisco / Agilent) (kant met de aanduiding "Agilent" down), op de top van pakking glijbaan en goed vast schroeven. </li><li> Hybridiseren 's nachts in 65 ° C oven, snelheid instelling op 10 toeren per minuut. </li><li> Om arrays, verwarm buffer 2 (Agilent) wassen tot 37 ° C. Uit elkaar te halen pakking schuif / array sandwich onderwater in buffer 1 (Agilent). Was in buffer 1 x 1 min. Was in de voorverwarmde buffer 2 x 1 min. Verwijder langzaam dia uit buffer 2, let daarbij goed op luchtbellen te vermijden (gebruik kimwipe om weg te lont extra vocht wordt voorzichtig om te voorkomen dat rechtstreeks aan te raken actieve kant van de array) </li><li> Plaats dia in diahouder en invoegen in array-scanner. </li></ol> 6. Virochip Scanning en analyse <ol><li> Scan Cy3-gelabeld array op 5 micrometer of 2 micrometer volgens de instructies van de standaard scanning protocol (Figuur 2B). </li><li> Analyseer Virochip microarrays door middel van visuele inspectie, cluster analyse, of de geautomatiseerde Virochip analyseprogramma, E-Predict 11. Door elk van deze drie methoden, is influenzavirus gemakkelijk gedetecteerd in de neus wattenstaafje monster (van een kind met influenza-achtig ziektebeeld) (figuur 2C) </li></ol> 7. Representatieve resultaten: Wanneer het protocol goed wordt gedaan, moet een uitstrijkje te zien op agarosegelelektroforese na de Rd stap B (Figuur 2A). De Virochip microarray op de Agilent platform zal moeilijk worden om visueel te analyseren (figuur 2B), maar als een virus aanwezig is moet het gemakkelijk worden geïdentificeerd door middel van visuele inspectie, cluster-analyse, en / of E-Voorspel (figuur 1C). Monsters kunnen worden verrijkt met afgepaste hoeveelheden nucleïnezuur van een bekend virus (bijv. tabak mozaïek virus; MS2 bacteriofaag) om te dienen als een positieve controle voor de test. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Schematische voorstelling van Virochip microarray verwerking en analyse. Extracted nucleïnezuur uit klinische monsters worden willekeurig versterkt, gelabeld met fluorescente kleurstoffen, en gehybridiseerd aan de Virochip microarray. Microarrays worden gescand op 2 micrometer resolutie en geanalyseerd met behulp van een verscheidenheid van computationele instrumenten, waaronder E-Predict. <img src="/files/ftp_upload/2536/2536fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Stappen in de Virochip assay Na amplificatie door willekeurige PCR, een uitstrijkje van 200 -. 1.000 bp kunnen worden gevisualiseerd door gelelektroforese (A) (B) Drie Virochip microarrays van de 8 arrays / glasplaatje worden getoond, met een kleine regio. van een microarray opgeblazen in de inzet op de rechter benedenhoek. (C) Geautomatiseerde microarray-analyse met behulp van virale E-Voorspel het openbaren van de aanwezigheid van influenza A-virus in de klinische monster. De hoge gelijkenis score (s = 0,55) komt overeen met een p-waarde die dicht bij nul, waardoor dit een zeer belangrijke voorspelling.

<ol><li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray-based+detection+and+genotyping+of+viral+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microarray-based detection and genotyping of viral pathogens.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 15687-15692 (2002).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+a+critical+respiratory+illness+caused+by+human+metapneumovirus+by+use+of+a+pan-virus+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of a critical respiratory illness caused by human metapneumovirus by use of a pan-virus microarray.</a> J Clin Microbiol. 45, 2340-2343 (2007).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+detection+of+human+parainfluenzavirus+4+infection+associated+with+respiratory+failure+in+an+immunocompetent+adult%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Microarray detection of human parainfluenzavirus 4 infection associated with respiratory failure in an immunocompetent adult.</a> Clin Infect Dis. 43, e71-e76 (2006).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+DNA+microarrays+for+detection+of+viruses+in+acute+respiratory+tract+infections+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Utility of DNA microarrays for detection of viruses in acute respiratory tract infections in children.</a> J Pediatr. 153, 76-83 (2008).</li>
<li>Kistler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-viral+screening+of+respiratory+tract+infections+in+adults+with+and+without+asthma+reveals+unexpected+human+coronavirus+and+human+rhinovirus+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Pan-viral screening of respiratory tract infections in adults with and without asthma reveals unexpected human coronavirus and human rhinovirus diversity.</a> J Infect Dis. 196, 817-825 (2007).</li>
<li>Rota, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+coronavirus+associated+with+severe+acute+respiratory+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome.</a> Science. 300, 1394-1399 (2003).</li>
<li>Wang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+discovery+and+sequence+recovery+using+DNA+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Viral discovery and sequence recovery using DNA microarrays.</a> PLoS Biol. 1, e2-e2 (2003).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+Gammaretrovirus+in+prostate+tumors+of+patients+homozygous+for+R462Q+RNASEL+variant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel Gammaretrovirus in prostate tumors of patients homozygous for R462Q RNASEL variant.</a> PLoS Pathog. 2, 25-25 (2006).</li>
<li>Kistler, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+divergent+avian+bornaviruses+from+cases+of+proventricular+dilatation+disease%3A+identification+of+a+candidate+etiologic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Virol+J%22%5BJournal%5D)">Recovery of divergent avian bornaviruses from cases of proventricular dilatation disease: identification of a candidate etiologic agent.</a> Virol J. 5, e25-e25 (2008).</li>
<li>Chiu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardioviruses+related+to+Theiler%27s+murine+encephalomyelitis+virus+in+human+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of cardioviruses related to Theiler's murine encephalomyelitis virus in human infections.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14124-14129 (2008).</li>
<li>Urisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-Predict%3A+a+computational+strategy+for+species+identification+based+on+observed+DNA+microarray+hybridization+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">E-Predict: a computational strategy for species identification based on observed DNA microarray hybridization patterns.</a> Genome Biol. 6, R78-R78 (2005).</li>
</ol>

De Virochip protocol zoals hier beschreven is complex en vereist een zorgvuldige en vakkundige research analist. De juiste reagens concentraties en de voorwaarden voor PCR, etikettering, en hybridisatie zijn van cruciaal belang. De Virochip protocol kan eenvoudig worden aangepast om de analyse van zieke weefsels door het gebruik van een tissue-extractie methode zoals TRIzol (Invitrogen) voor nucleïnezuur extractie tegemoet te komen. Probes kunnen worden toegevoegd of verwijderd als nodig is om het gewenste spectrum en de breedte van de dekking te verkrijgen, bijvoorbeeld, probes voor de detectie van niet-virale doelstellingen zoals bacteriën en schimmels kunnen worden ontworpen en toegevoegd &quot;on-the-fly&quot;. Enkele toepassingen van de Virochip test momenteel in ontwikkeling zijn onder een breed spectrum virale diagnostiek in het klinisch laboratorium, onderzoeken van uitbraken, zuiverheid screening van geneesmiddelen en vaccins, en nieuwe virale ziekteverwekker ontdekking.

<table border="1"><tbody><tr><th> Naam van het reagens / materiaal </th><th> Naam van het reagens / materiaal </th></tr><tr><td> Primera </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-(N9) -3 &#39; </td></tr><tr><td> Primer B </td><td> 5&#39;-GTTTCCCAGTCACGATA-3 &#39; </td></tr><tr><td rowspan="5"> RT Master Mix (5 pi) </td><td> 2 pl 5X RT buffer </td></tr><tr><td> 1 ui 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 ui water </td></tr><tr><td> 0,5 pi 0,1 M DTT </td></tr><tr><td> 0,5 pi SSIII RT (Invitrogen) </td></tr><tr><td rowspan="3"> Sequenase Mix (5 pi) </td><td> 1 ui 5X Sequenase buffer </td></tr><tr><td> 3,8 pi water </td></tr><tr><td> 0,15 pi Sequenase (USB Corporation) </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd B PCR Master Mix (45 pi) </td><td> 5 ul 10X PCR-buffer </td></tr><tr><td> 1 ui 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 pi 100 pmol / ul primer B </td></tr><tr><td> 1 pi KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 pi water </td></tr><tr><td rowspan="5"> Rd C PCR Master Mix (45 pi) </td><td> 5 uL 10X PCR-buffer </td></tr><tr><td> 1 ui 12,5 mM dNTP (Invitrogen) </td></tr><tr><td> 1 pi 100 pmol / ul primer B </td></tr><tr><td> 1 pi KlenTaq LA (Sigma) </td></tr><tr><td> 37 pi water </td></tr><tr><td rowspan="4"> Hybridisatiebuffer (25 pi) </td><td> 1 ui 25X fragmentatie buffer (Agilent) </td></tr><tr><td> 5 ui 5X blokkerende buffer (Agilent) </td></tr><tr><td> 9,5 pi (of het bedrag te normaliseren) van Cy3-gelabelde sample </td></tr><tr><td> Verdun met water tot totaal volume van 25 ui </td></tr><tr><td> Agilent Virochip microarray </td><td> vergunning verlenen in afwachting; die beschikbaar zijn vanaf Chiu laboratorium, UCSF </td></tr></tbody></table>

met behulp van een pan-viral microarray assay (virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

De diagnose van virale oorzaken van veel besmettelijke ziekten is het moeilijk te wijten aan de inherente volgorde diversiteit van virussen, alsook de voortdurende opkomst van nieuwe virale pathogenen, zoals SARS coronavirus en 2009 pandemische H1N1-influenzavirus, die niet opspoorbaar zijn door de traditionele methoden. Om deze uitdagingen, hebben we eerder ontwikkeld en gevalideerd een pan-virale microarray platform genaamd de Virochip met de capaciteit om alle bekende virussen, alsmede nieuwe varianten te detecteren op basis van de geconserveerde sequentie homologie 1. Met behulp van de Virochip, hebben we het volledige spectrum van virussen geassocieerd met infecties van de luchtwegen, met inbegrip van gevallen van onverklaarbare kritieke ziekte in het ziekenhuis opgenomen patiënten, met een gevoeligheid gelijk is aan of beter dan de conventionele klinische tests 2-5. De Virochip is ook gebruikt om nieuwe virussen te identificeren, met inbegrip van het SARS-coronavirus 6,7, een roman rhinovirus clade 5, XMRV (een retrovirus gekoppeld aan prostaatkanker) 8, Avian Borna Virus (de oorzaak van een slopende ziekte in papegaaien) 9, en een nieuwe cardiovirus bij kinderen met ademhalings-en diarree 10. De huidige versie van de Virochip is geschikt gemaakt voor een Agilent microarray platform en bestaat uit ~ 36.000 probes afgeleid van meer dan ~ 1500 virussen in GenBank ingang van december 2009. Hier laten we zien de stappen die betrokken zijn bij de verwerking van een Virochip test van start tot finish (~ 24 uur doorlooptijd), met inbegrip van steekproefsgewijze nucleïnezuur-extractie, PCR-amplificatie met behulp van willekeurige primers, fluorescente kleurstof oprichting, en microarray hybridisatie, scannen en analyse.

De Virochip is een pan-virale microarray ontworpen om gelijktijdig alle bekende virussen, alsmede nieuwe virussen te detecteren op basis van de geconserveerde sequentie homologie. Hier laten we zien hoe een Virochip test uitvoeren om klinische monsters te analyseren op de aanwezigheid van zowel bekende als onbekende virussen.

Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen

De diagnose van virale oorzaken van veel infectieziekten is moeilijk vanwege de inherente sequentiediversiteit van virussen, evenals het voortdurende ontstaan ...

Deze procedure maakt gebruik van de Viro chip, een pan-virale microarray-assay om klinische monsters te analyseren op zowel bekende als onbekende virussen. Eerst worden nucleïnezuren uit de klinische monsters geëxtraheerd. Vervolgens wordt het geëxtraheerde RNA teruggetranscribeerd met behulp van random primers.De synthese van de tweede streng cDNA wordt uitgevoerd en de cDNA-bibliotheek wordt geamplificeerd met random PCR. Vervolgens wordt het geamplificeerde cDNA gelabeld met fluorescerende kleurstoffen en gehybridiseerd op een virale chip-microarray. De laatste stap is het scannen en analyseren van de microarray.Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de aanwezigheid of afwezigheid van een virus of meerdere virussen aantonen via analyse van de chip-microarray. Breed-spectrum detectiemethoden, zoals een virale chip-microarray, zijn noodzakelijk in de diagnostische microbiologie omdat veelvoorkomende klinische syndromen, zoals pneumonie, niet specifiek zijn voor één individueel pathogeen, en vanwege de voortdurende dreiging van nieuwe virale pathogenen, zoals het SARS-coronavirus en het nieuwe H1N1-influenzavirus van 2009. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de diagnostische microbiologie, zoals welk percentage van de niet-gediagnosticeerde infecties in een klinische setting kan worden veroorzaakt door tot nu toe niet geïdentificeerde nieuwe virussen. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot een betere diagnose van acute klinische aandoeningen in het ziekenhuis, omdat we gelijktijdig testen op honderden tot duizenden potentiële pathogenen.We kregen voor het eerst het idee voor deze methode in 2002, toen we besloten de onlangs ontwikkelde microarray-technologie, gepionierd in het laboratorium van Dr. Joseph DeRisi aan de UCSF, toe te passen op de detectie van virussen. Onze eerste praktijktest was het gebruik van de virale chip om in 2003 een nieuw coronavirus te identificeren dat verantwoordelijk was voor SARS. Om de procedure van begin tot eind te demonstreren, zal een technicus uit mijn laboratorium laten zien hoe de virale chip-assay wordt gebruikt op een neusswabmonster van een kind om de oorzaak van haar acute respiratoire aandoening te diagnosticeren. Nasopharyngeale swabmonsters worden verzameld in steriele containers met viraal transportmedium en bevroren bewaard in een vriezer van -80 °C.Laat de buis met het monster in een biosafety-kast ontdooien en roer de wattenstaaf kort in het medium voordat u de wattenstaaf weggooit in een container voor biologisch gevaarlijk afval. Pipetteer vervolgens 200 µL van het monster in een buisje van 1,5 mL. Filter het monster door een spinfilter van 0,22 micron om virale deeltjes te zuiveren en vang dit op in een nieuw buisje van 1,5 mL.Gebruik vervolgens de Turbo DNA-kit van Ambien volgens de instructies van de fabrikant om gastheer-genomisch DNA af te breken en het ingekapselde beschermde virale nucleïnezuur te zuiveren. Voer daarna RNA-extractie uit met de XMO ZR virale RNA-extractiekit of de Qiagen ultrasound viruskit volgens de instructies van de fabrikant. Meet de concentratie van het geëxtraheerde RNA met een NanoDrop nucleïnezuur-spectrofotometer.De RNA-concentratie is bij voorkeur ten minste 10 ng/µL, maar dit zal per monster variëren bij gebruik van een dunwandige buis van 200 µL. Voeg één µL primer A met een concentratie van 40 pmol/µL toe aan vier µL geëxtraheerd RNA. Verwarm het monster gedurende vijf minuten op 65 °C in een thermocycler en laat de buis vervolgens vijf minuten afkoelen tot kamertemperatuur.Voeg vervolgens vijf µL van een mastermix toe aan een thermocycler, bestaande uit twee µL 5× RT-buffer, één µL 12,5 mM dNTP, één µL water, 0,5 µL 0,1 M DTT en 0,5 µL reverse transcriptase. Incubeer de buis 60 minuten bij 42 °C. Verhit het monster vervolgens twee minuten bij 94 °C.Om de reverse transcriptase-reactie te stoppen, koelt u af naar 10 °C gedurende twee minuten en centrifugeert u kort gedurende vijf seconden. Voeg vervolgens vijf µL quease-mengsel toe, bestaande uit één µL vijfvoudige quease-buffer, 3,8 µL water en 0,15 µL quease voor de synthese van de tweede streng. Verwarm de thermocycler geleidelijk van 10 °C naar 37 °C gedurende acht minuten.Houd 8 minuten op 37 °C. Verhit vervolgens 2 minuten tot 94 °C om het enzym te inactiveren en koel op dit punt af tot 10 °C. Indien gewenst kan het monster met 15 µL cDNA worden bewaard bij -20 °C.Voeg eerst vijf µL CD NA-monster toe aan 45 µL van een mastermix bestaande uit vijf µL 10× PCR-buffer, één µL 12,5 mM dNTP, één µL 100 pmol/µL primer B, één µL cleantech LA en 37 µL water. Voer vervolgens het PCR-protocol als volgt uit: 94 °C gedurende twee minuten, gevolgd door 25 cycli van 94 °C gedurende 30 seconden, 50 °C gedurende 45 seconden en 72 °C gedurende één minuut.Vervolgens volgt een annealing-stap van 72 °C gedurende vijf minuten, gevolgd door een hold op 10 °C na de PCR. Controleer het PCR-product op een 1,5% agarose-elektroforesegel. Er moet een smear zichtbaar zijn van ongeveer 200 tot 1000 baseparen.Om AAD DNTP in te bouwen, voegt u vijf µL viraal PCR-product toe aan 45 µL van een mastermix bestaande uit vijf µL 10× PCR-buffer, één µL 12,5 mM A-A-D-N-T-P, één µL 100 p van meerdere µL primer B, één µL ClinTech LA en 37 µL water. Voer het PCR-protocol als volgt uit: 94 °C gedurende twee minuten, 15 cycli van 94 °C gedurende 30 seconden en 50 °C gedurende 45 seconden.72 °C gedurende één minuut, gevolgd door een annealingsstap van 72 °C gedurende vijf minuten en vasthouden op 10 °C. Reinig vervolgens het nieuwe PCR-product met de DNA Clean & Concentrator 3-kit volgens de instructies van de fabrikant en los dit op in 10 µL elutiebuffer. Voeg één µL 1 M bicarbonaat en één µL si3 toe aan de 10 µL PCR-product en incubeer dit gedurende één uur in het donker.Reinig vervolgens opnieuw het S-gelabelde monster met de DNA Clean and Concentrator 5-kit en elueer in 12 µL elutiebuffer. Gebruik 1,5 µL van het monster om de cDNA-concentratie en de hoeveelheid ingebouwde kleurstof te controleren met een NanoDrop-spectrofotometer in een PCR-stripbuis met 1 µL 25× fragmentatiebuffer, 5 µL 5× blokkeringsbuffer, 9,5 µL of de benodigde hoeveelheid voor een genormaliseerde uiteindelijke concentratie van 10 pM of pmol/µL van het SI3-gelabelde monster en water tot een totaalvolume van 25 µL. Voeg vervolgens 25 µL 2× GX-hybridisatiebuffer toe en centrifugeer kort om luchtbellen te verwijderen.Plaats een nieuwe gasket-dia in de hybridisatiekamer. Breng 40 µL van het monster aan op de gasket-dia. Plaats vervolgens de Agilent geprinte virale array met de zijde die is gemarkeerd met Agilent naar beneden op de gasket-dia en draai de schroef stevig vast.Plaats de hybridisatiekamer in een oven van 65 °C en hybridiseer gedurende de nacht met een langzame rotatie van 10 rotaties per minuut om de arrays te wassen. Verwarm eerst buffer twee voor tot 37 °C tijdens het opwarmen. Vul een plastic container van 500 ml met ongeveer 250 ml buffer één.Verwijder de array uit de hybridisatiekamer, dompel de array onder en scheid deze van de gasket-dia. Verplaats de array naar de schone container en was deze gedurende één minuut in buffer één. Gebruik vervolgens een aparte plastic container van 500 milliliter.Was de array gedurende één minuut in voorverwarmde buffer twee. Verwijder de array na het wassen langzaam uit buffer twee, waarbij u er zorgvuldig op let dat er geen luchtbellen ontstaan.Gebruik een kimwipe om overtollig vocht weg te trekken, waarbij u er zorgvuldig op let dat u de actieve zijde van de array niet rechtstreeks aanraakt. Plaats tot slot de slide met de Agilent-zijde naar boven in de slidehouder en voer deze in de array-scanner in. In deze procedure gebruiken we een Agilent two micron DNA-microarray-scanner.Scan de gelabelde SI three array bij vijf micron of twee micron volgens het standaard scanprotocol van het instrument. Analyseer virale chipp microarrays via clusteranalyse of het automatische RO chipp analyseprogramma e unpredic. Met behulp van de Viro Chipp microarray kan het nieuwe influenza H one N one virus in 2009 gemakkelijk worden gedetecteerd in het neusswabmonster van een kind met een influenza-achtige ziekte.Daarnaast hebben we aangetoond dat de virale chip niet alleen in staat is om respiratoire virussen te identificeren, maar ook een breed scala aan virussen uit diverse verschillende weefsels en lichaamsvloeistoffen. Enkele voorbeelden van virusdetectie in volbloed en serum met behulp van de vichi, zoals hier getoond. Dit zijn resultaten die overeenkomen met de viro chip-microarray van bloedmonsters, zijnde volbloed of serum afgenomen van vier patiënten; voor elk monster worden de twee beste virusvoorspellingen getoond, waarbij de beste virusvoorspelling de laagste P-waarde heeft.Bijvoorbeeld, in het lichtblauw gemarkeerde monster is de belangrijkste voorspelling denguevirus type 1. Hoewel de tweede voorspelling denguevirus type 2 is, werd het feitelijke virus in dat volbloedmonster inderdaad bevestigd als denguevirus type 1, in overeenstemming met de dict-resultaten. Een andere toepassing van de viro chip is de ontdekking van nieuwe pathogenen.Enkele voorbeelden zijn de ontdekkingen van sars-coronavirussen, X-M-R-V-A, het OME-retrovirus dat gelinkt is aan prostaatkanker en chronisch vermoeidheidssyndroom bij mensen, en HTCV, een nieuw menselijk cardiovirus dat geassocieerd wordt met respiratoire infecties en diarree bij kinderen. Zodra deze techniek beheerst is, kan deze in 12 uur worden uitgevoerd indien deze correct wordt uitgevoerd. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om ervoor te zorgen dat alle benodigde apparatuur en reagentia beschikbaar zijn volgens deze procedure.Andere methoden, zoals specifieke virale PCR-amplificatie en deep sequencing, kunnen worden uitgevoerd om ongebruikelijke viral chip-hybridisatiepatronen of viral chip-resultaten te bevestigen en op te volgen die na de ontwikkeling wijzen op de aanwezigheid van een nieuw virus. Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor onderzoekers in het veld van de oncologie om de associatie van nieuwe virussen met kanker te onderzoeken, in de velden van bioverdediging en klinische microbiologie om gecondenseerde micro-gebaseerde assays te ontwikkelen voor snelle pathogeendiagnostiek, en in het veld van de virologie voor de karakterisering van nieuwe virussen en hun associatie met ziekten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u alle stappen van de viral chip microarray-assay moet uitvoeren, een breedspectrum surveillancetest om virale pathogenen in klinische monsters te detecteren, vanaf de extractie van nucleïnezuren uit klinische monsters tot aan de microarray-hybridisatie en analyse.Vergeet niet dat het werken met klinische monsters als biologisch gevaarlijk wordt beschouwd en dat de extractie van nucleïnezuren moet worden uitgevoerd in laboratoria met een biosafety-niveau twee of hoger.

using-pan-viral-microarray-assay-virochip-to-screen-clinical-samples

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde multiplex reverse transcriptase kwantitatieve PCR (qRT-PCR)-protocol in combinatie met een microfluïdisch platform als een kost en tijd efficiënte high-throughput screening tool voor microRNA (miRNA) expressie niveaus, in het bijzonder bij het werken met beperkte hoeveelheden van het monster.

High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

In this video, we demonstrate the process for detecting antibody isotypes in multiple human serum samples using a microarray slide printed with antigenic subtypes of influenza virus strains.

Viral Antigen Microarray Assay to Detect Antibody Isotypes in Serum Against Viral Antigen

This video demonstrates a viral attachment assay for screening antiviral compounds. Using genetically modified hepatitis C virus and luciferase, it assesses inhibitory effects on viral attachment, as indicated by lower light intensity in co-treated wells compared to wells treated with the virus alone.

A Viral Attachment Assay for Screening of Antiviral Compounds

Een geïntegreerde microfluïdische thermoplastische chip is ontwikkeld voor gebruik als een moleculaire diagnostische. De chip voert nucleïnezuur extractie, reverse transcriptase, en PCR. Werkwijzen voor het vervaardigen en gebruiken van een chip worden beschreven.

Microfluïdische chip fabricage en methode om Influenza Detect

Menselijke endogene retrovirussen (HERV), die 8% van het menselijk genoom bezet, behoudt schaarse coderende capaciteit maar honderdduizend lange terminale herhalingen (LTR). Een aangepaste Affymetrix microarray werd ontworpen om individuele herv locus expressie te identificeren en werd gebruikt op prostaatkanker weefsels als een proof of concept voor toekomstige klinische studies.

Microarray-gebaseerde identificatie van individuele herv Loci Expression: Toepassing op Biomarker Discovery bij prostaatkanker

Drie assays, zoals de cytopathische effect (CPE) gebaseerde bepaling, dosis-respons assay en tijd-van-toevoeging (ToA) assay ontwikkeld, geoptimaliseerd, gevalideerd en toegepast op nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus (BTV) identificeren alsmede zoals het bepalen van de mogelijke mechanisme-van-actie (MoA) voor nieuw geïdentificeerde antivirale middelen.

Testsystemen voor de identificatie van nieuwe antivirale middelen tegen Bluetongue virus

In vitro assays om virusreplicatie te meten zijn sterk verbeterd door de ontwikkeling van recombinante RNA-virussen tot expressie luciferase of andere enzymen die in staat bioluminescentie. Hier hebben we detail een high-throughput screening pijplijn dat dergelijke recombinante stammen van mazelen en chikungunya virussen breed-spectrum antivirale middelen te isoleren van chemische bibliotheken combineert.

High-throughput screening voor Breed-spectrum Chemische Remmers van RNA-virussen

High-throughput testen van DNA en RNA gebaseerde pathogenen op nanoschaal PCR wordt omschreven met een syndromale honden en paarden luchtwegen PCR panel.

High-throughput detectie van respiratoire pathogene in dierlijke specimens door nanoschaal PCR

We presenteren een high-throughput flowcytometrische analyse naar de fagocytaire activiteit van antigeen-specifieke antilichamen uit klinische monsters te bepalen, met behulp van fluorescerende antigeen-gecoate kralen en een monocytische cellijn die meerdere Fc-receptoren, die receptor gebruik en de fagocytische activiteit bepalingen in een gestandaardiseerd en reproduceerbare mode voor elk antigeen van belang.

Het bepalen van de fagocytaire activiteit of Clinical antilichaammonsters

De bevindingen en conclusies in dit rapport zijn die van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijkerwijs de mening van de Centers for Disease Control and Prevention.

Tot oprichting van een Liquid bedekte cultuur van gepolariseerde menselijke luchtwegen Epiteel Calu-3 cellen aan Host Cell Reactie op respiratoire pathogenen Studie<em&gt; In vitro</em

Leer de Virochip-microarray-assay voor het detecteren van virale pathogenen in klinische stalen. Deze methode identificeert zowel bekende als nieuwe virussen via sequentiehomologie en verbetert de diagnostische nauwkeurigheid.

Met behulp van een Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) op klinische stalen scherm voor virale pathogenen

Meer video's verkennen