DNA Microarrays: Voorbeeld Quality Control, Array Hybridisatie en scannen
15 maart 2011
We demonstreren het gebruik van DNA-microarrays voor expressie profilering van het zenuwstelsel. We beschrijven RNA kwaliteitscontrole, monster etikettering, en array-hybridisatie en scannen.
Het algemene doel van deze procedure is om een microarray-experiment uit te voeren met behulp van een geautomatiseerd mixerapparaat. Dit wordt bereikt door eerst de kwaliteit van de RNA-monsters te analyseren met de bioanalyzer, na amplificatie en markering van het RNA. De RNA-monsters worden gehybridiseerd op de microarrays.
Ten slotte worden de gehybridiseerde microarrays gewassen en gescand. Uiteindelijk worden resultaten verkregen die de differentiële expressie van RNA-transcripten tonen door analyse van dual-color fluorescentie microarray-beelden. Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de microarray hybridisatie stappen moeilijk te leren zijn vanwege de gespecialiseerde apparatuur.
De kwaliteitscontroleanalyse begint met de voorbereiding van het 2.100 bioanalyzer instrument en de chip priming station zoals aangegeven in de geschreven procedure. De gelmatrix wordt vervolgens gefilterd door 550 microliters in een spinfilter te pipetten dat wordt geleverd met RNA 6.000 nano kit centrifuge. De filter bij 1.500 RCF gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
Deel vervolgens het gefilterde gel in 65 microliter aliquoten, die kunnen worden bewaard bij vier graden Celsius voor maximaal één maand. Vorm de kleurconcentraat gedurende 10 seconden en voeg een microliter toe aan een 65 microliter aliquot. Een gefilterde gel na het vortexen van het mengsel centrifuge bij 13.000 RCF gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur om de monsters te draaien.
Plaats eerst een chip op de priming station. In deze demonstratie worden RNA 6.000 nano chip gebruikt. Laad negen microliter van de gel kleurmengsel in de put gemarkeerd met een witte G tegen de zwarte achtergrond.
Met de pipettip gepositioneerd op de bodem van de put. Plaats de spuit plunjer op één milliliter en sluit de priming station. Druk de plunjer langzaam maar gestaag naar beneden totdat deze wordt vastgehouden door de clip.
Na 30 seconden, laat de clip los en laat de plunjer een paar seconden stijgen. Nadat de plunjer stopt, trek de plunjer terug naar de één milliliter positie en open de priming station. Laad negen microliter van de gel dood.
Meng in elk van de twee putten. Mark G.Vervolgens zet vijf microliter van de marker in de ladder put en in elk van de 12 monsters putten. Laad vervolgens één microliter van de gedenatureerde ladder in de ladder put en één microliter van elk gedenatureerd monster in de monsters putten.
Ten slotte voeg één microliter van de marker toe aan elke ongebruikte monster. Eenmaal geladen, vortex de chip gedurende één minuut bij 2.400 RPM. Na het starten van de 2.100 expert software, plaats de chip en sluit het deksel.
Zorg ervoor dat de juiste poort is geselecteerd en voer de test uit binnen vijf minuten na het laden van de monsters om verdamping te voorkomen. Methoden voor het uitvoeren van RNA-amplificatie en markering zijn te vinden in het geschreven protocol. Eenmaal gelabeld, zuiver de CRNA om niet-geïncorporeerde nucleotiden te verwijderen. Met behulp van cogens r een easy mini kolommen, kan de gelabelde CRNA vervolgens worden gekwantificeerd met een NanoDrop 2000 spectra fotometer.
In microarray meetmodus, neem de monsterconcentratie, opbrengst en specifieke activiteit op. Voor microarray hybridisatie, is het noodzakelijk om een opbrengst van minimaal 825 nanogram en een specifieke activiteit van minimaal acht picomol per microgram te bereiken ten minste twee uur voorafgaand aan de microarray hybridisatie. Zet de hybridisatie station aan en stel in op 65 graden Celsius.
Dit protocol beschrijft het gebruik van Agilent vier door 40 4K arrays met het Roche nimble gen hybridisatie systeem en een vier mixer kamers na CRNA fragmentatie uitgevoerd zoals beschreven in het geschreven protocol, bereid de hybridisatie kamer voor. Plaats een microarray slide in de montage ontmanteling tool streepjescode zijde. Open eerst een A vier mixer en exposeer de kleefstof die de array en montage ontmanteling tool vasthoudt om beweging te voorkomen.
Plaats de A vier mixer op de slide beginnend aan de verre kant. Zorg ervoor dat het correct is uitgelijnd met de tool en bevestig de mixer langs de array. Trek vanaf het uiteinde van de mixer om de slide mixer samenstelling te verwijderen.
Gebruik het schuurgereedschap om langs de kleefstof gasket te drukken om ervoor te zorgen dat deze stevig aan de slide is gelijmd. Kleine luchtbellen die vastzitten tussen de kleefstof en de slide zijn te zien tegen de donkere achtergrond. Neem extra tijd om deze bellen te verwijderen met het schuurgereedschap.
De array is nu klaar om te worden geladen. Gebruik een positieve verplaatsing perpet om 100 microliter van het hybridisatie monster te laden. Duw de tip stevig binnen in de poort en doseer langzaam en soepel zodat de lucht niet vast komt te zitten in het array gebied.
Wanneer het monster de hele array bedekt en vloeistof uit de ventilatiepoort begint te komen, verwijder snel de pipet en laat de plunjer los. Zodra de tip weg is van de slide, dep voorzichtig het overtollige vloeistof bij beide poorten, zorg ervoor dat u geen monster uit de kamer zelf trekt. Bedek vervolgens de poorten met stickers met behulp van pincetten.
Plaats de slide op de hybridisatie station en controleer dat de blaasjes gaten correct zijn gepositioneerd over de O-ringen. Dit zorgt voor goede menging tijdens hybridisatie. Sluit de slide deksel en het station deksel.
Stel de station in de mengmodus B en hybridiseer de array bij 65 graden Celsius gedurende 17 uur. Eenmaal klaar vult u glazen schaal gelabeld A met was buffer een, de schaal moet groot genoeg zijn om het montage ontmanteling tool te houden en wat manoeuvreren mogelijk te maken. Alle wasbeurten moeten worden gedaan in glaswerk omdat plastic neiging heeft om verbindingen uit te lekken, wat resulteert in een hoge achtergrond in de array.
Plaats een slide rack en een roerstaaf in een kleuring schaal. Gelabeld B, vul de schaal met was buffer een die de rack bedekt en plaats de schaal op een roerplaat bij kamertemperatuur. Voeg ook een roerstaaf toe aan een lege kleuring schaal gelabeld C en plaats deze op een roerplaat.
Verwijder de array van de hybridisatie station en plaats deze in het montage ontmanteling tool. Dompel de hele samenstelling in schaal a terwijl u he
Overzicht
Dit artikel demonstreert het gebruik van DNA-microarrays voor expressieprofilering in het zenuwstelsel. Het beschrijft de processen van RNA-kwaliteitscontrole, monsterlabeling, en de hybridisatie en scanning van arrays.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Genomics
- Microarray Technologie
Achtergrond
- Microarrays zijn krachtige hulpmiddelen voor het analyseren van genexpressie.
- RNA-kwaliteitscontrole is cruciaal voor betrouwbare resultaten.
- Fluorescentiebeeldvorming wordt gebruikt om differentiële RNA-transcriptexpressie te beoordelen.
- Gespecialiseerde apparatuur is noodzakelijk voor hybridisatie en scanning.
Doel van Studie
- Om een gedetailleerd protocol te bieden voor het uitvoeren van microarray-experimenten.
- Om de belangrijkheid van RNA-kwaliteit in microarray-analyse te benadrukken.
- Om het hybridisatieproces met behulp van geautomatiseerde apparatuur te demonstreren.
Gebruikte Methoden
- RNA-kwaliteitsbeoordeling met behulp van een bioanalyzer.
- Monsterlabeling en amplificatieprotocollen.
- Hybridisatie van RNA-monsters naar microarrays.
- Scannen en analyseren van dual-color fluorescentiebeelden.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle hybridisatie en scanning van microarrays werden bereikt.
- Resultaten gaven differentiële expressie van RNA-transcripten aan.
- Kwaliteitscontrolemaatregelen zorgden voor betrouwbare dataverwerving.
- Visuele demonstraties vergemakkelijkten het begrijpen van complexe procedures.
Conclusies
- Het protocol biedt een uitgebreide gids voor RNA-microarray-experimenten.
- Kwaliteitscontrole is essentieel voor nauwkeurige genexpressieprofilering.
- Geautomatiseerde systemen verhogen de efficiëntie van microarray-analyse.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
DNA microarray expression profiling enables biopharma R&D teams to interrogate transcriptional responses in disease-relevant neural systems, supporting target validation and mechanistic de-risking. Quantitative dual-color hybridization provides predictive confidence in gene expression changes, informing go/no-go decisions in early discovery. This workflow positions RNA quality control and hybridization as foundational steps for scalable, reproducible screening assays in neuroscience-focused drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional pathways in brain tumor tissue to clarify disease mechanisms and prioritize targets.
- Operational Value: RNA integrity number (RIN) from Bioanalyzer QC ensures sample suitability, reducing false negatives in downstream profiling.
- Predictive Value: Dual-color Cy3/Cy5 ratio measurements detect small expression changes, increasing confidence in target engagement signals.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Labeled cRNA yield (≥825 ng) and specific activity (≥8 pmol/µg) thresholds ensure assay readiness for hybridization.
- Operational Value: Automated mixer apparatus and standardized wash buffers improve reproducibility across runs.
- Scalability: Agilent 4x44 K arrays allow parallel interrogation of thousands of genes per sample, supporting medium-throughput screening.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Differential expression profiling in human brain tumor tissue aligns with preclinical models of glioma.
- Mechanistic De-risking: Identifies co-regulated gene networks that may indicate off-target effects or pathway compensation.
- Biomarker Alignment: Stable reference sample (Cy5) enables intra-experiment normalization, supporting longitudinal biomarker tracking.
Pipeline & Workflow Integration
The microarray workflow fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification, where transcriptional profiling informs target selectivity and pathway modulation.
- Discovery Biology: Bioanalyzer QC and RIN measurement support hypothesis testing by ensuring RNA quality before labeling.
- Screening: Hybridization to Agilent arrays with dual-color detection enables quantitative comparison of experimental vs. reference samples.
- Analytics: Signal histograms and scatterplots from GenePix 4000B scanner provide overlapping dynamic ranges for accurate fold-change calculation.
- Translational Research: Differential expression in tumor tissue supports preclinical validation of target relevance in neoplastic pathways.
- Enterprise Reuse: Standardized QC, labeling, and hybridization protocols allow reuse across CNS disease models (e.g., Alzheimer’s, Parkinson’s).
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reproducible, quantitative expression profiling.
- Operational Value: Standardized RNA QC (RIN), labeling yield thresholds, and hybridization conditions reduce variability.
- Strategic Value: Enables early de-risking of targets by revealing transcriptional consequences of modulation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying targets with coherent pathway-level effects.
Implementation Considerations
- Expertise in RNA handling, labeling, and microarray hybridization is required.
- Instrumentation includes Agilent 2100 Bioanalyzer, NanoDrop 2000, hybridization station, and GenePix 4000B scanner.
- Cross-team standardization requires adherence to RNA yield (≥825 ng), specific activity (≥8 pmol/µg), and wash buffer protocols.
- Adaptation to other model systems necessitates re-validation of RNA integrity and labeling efficiency.
- Ozone sensitivity of Cy5 dye requires minimized air exposure during washing and scanning.
