High Throughput MicroRNA Profiling: Geoptimaliseerd Multiplex qRT-PCR op nanoliter Schaalverdeling op de Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

Het algemene doel van deze procedure is om micro RNA-expressie efficiënt, goedkoop en met minimaal startmateriaal te profileren door multiplex kwantitatieve R-T-P-C-R te combineren met een microfluïdisch platform. Dit begint met het concentreren van geëxtraheerd RNA, gevolgd door multiplex reverse transcriptie en multiplex pre-amplificatie. De volgende stap is het zuiveren van overtollige primers.

Ten slotte wordt singleplex micro RNA-expressie geprofileerd met behulp van een microfluïdisch platform. Het resultaat is nauwkeurige en zeer reproduceerbare micro RNA-expressieniveaus tussen monsters van belang. Het belangrijkste voordeel van deze techniek van bestaande methoden is dat de extra zuiveringsstap na pre-EMP-amplificatie de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de multiplex Q-R-T-P-C-R-methode verbetert.

Begin met RNA dat is geëxtraheerd uit serum. Gebruik een RNA-zuiveringskit of fenol chloroform gebaseerde RNA-methode van gehomogeniseerd weefsel zoals triol, alle extracties moeten gevolgd worden door een spoelprocedure en alle opslag gebeurt bij min 80 graden Celsius. Concentreer de RNA-oplossing.

Als je met een beperkte hoeveelheid monster begint, zoals uit serum, plaats dan eerst een MicroCon-monsterreservoir in een vat en pipet de RNA-oplossing in het reservoir, wees heel voorzichtig om de membraan niet aan te raken met de pipettentip. Plaats nu het vat en filter in de centrifuge met de crackband naar de rotor toe en laat de centrifugatie ongeveer drie uur draaien. Na drie uur zal het RNA volledig geconcentreerd zijn op de membraan om het RNA elueren.

Voeg een gewenste hoeveelheid RNAs vrije water toe aan de membraan, draai het reservoir om en plaats het in een nieuw vat. Draai vervolgens drie minuten bij vier graden Celsius met maximaal 3000 keer G.Bewaar het geconcentreerde RNA bij min 80 graden Celsius tot het nodig is Na het uitvoeren van een RT-reactie op het RNA met behulp van xpl reverse stem loop primers, gevolgd door 12 tot 18 rondes van PCR-cycli. De microRNA's worden weergegeven door CD NA-strengen.

Dit wordt het pre PCR-product genoemd. Verwijzend naar de aankomende QPCR. Het pre PCR-product moet worden gezuiverd op een 10% polyacrylamidegel naast een 10 basenpaar DNA ladder, laad elke baan met 5,5 microliters van zes x oranje G gecombineerd met 27,5 microliters van pre PCR-product.

Laat de gel draaien op 150 volt gedurende 55 tot 60 minuten. Romo fenolblauw loopt op deze gel in het 20 basenpaargebied. Nadat de gel is gelopen, kleurt u deze 25 minuten met cyber goud, niet blootgesteld aan het licht en op een shaker vanaf de gekleurde gel.

Knip de pre PCR-productband uit van 60 tot 80 basenparen en breng de gelblok over naar gelabelde buisjes. Als de productconcentratie laag is, is deze mogelijk niet zichtbaar, maar zal deze nog steeds in de gel aanwezig zijn. Vergruis nu de gelband met behulp van tube-in-tube centrifugatie en voeg 300 microliter TEN-buffer toe.

Incubeer de buffergelmix gedurende vier uur bij 37 graden Celsius met roeren. Na vier uur brengt u de vloeistof over in een nieuwe buis en voegt u nog eens 300 microliter TEN-buffer toe. Incubeer deze mix een nacht bij vier graden Celsius met roeren.

De volgende dag brengt u de inhoud van de buis over en gaat u verder met een ethanolprecipitatie van het pre PCR-product. Wanneer een chip uit de verpakking wordt geopend, moet deze binnen 24 uur worden geprimed en vervolgens binnen 60 minuten na het primen worden geladen. Begin met het primen van de array door 150 microliter controlevloeistof in elk van de accumulatoren op de chip te injecteren.

Zorg ervoor dat er geen vloeistof op de chip of in de inlaten morst, anders wordt de chip onbruikbaar. Plaats vervolgens de chip in de geïntegreerde vloeistofcircuit of IFC-controller en voer het priming script van de controller uit. Zodra het programma begint, begint u met het voorbereiden van de monsters.

Begin met het voorbereiden van de pres-monstermix. Meng een combinatie van tack man, universele mastermix en laadreagentia. Gebruik vervolgens het 96-wells laadformaat om 2,25 microliters van elk monster te combineren met 2,75 microliters van de pres-monstermix om de geladen vloeistof te verzamelen. Vorm kort en centrifugeer snel de plaat bij vier graden Celsius.

De monsterplaat is nu voorbereid. Gebruik nu een nieuwe 96-wellsplaat om 13 x concentraties van het assaymengsel voor te bereiden. Dit gebeurt door in elke put een universele primer, voorwaartse primer en genspecifieke tac man sonde te mengen.

De één X-concentraties zijn één micromolar voor de universele en voorwaartse primer en 0,2 micromolar voor de tac man sonde. Voeg vervolgens voldoende tween toe voor een eindconcentratie van 0,25% tween in een eindvolume van vijf microliters. Meng goed en vermijd bellen en draai kort de plaat om de vloeistof te verzamelen.

Dit is de assayplaat. Begin met de 96.96 Q-R-T-P-C-R door de chip te laden. Laad eerst de monsters en vervolgens de assays met het eindvolume van vijf microliters per inlaat naar de IFC.

Tweede, voer het load mix script uit om de monsters en assays in de chip te laden. Wanneer het script voorbij is, trek de beschermende film van de geladen chip en verwijder eventuele stofdeeltjes of puin van het oppervlak van de chip met behulp van plakband. Stel nu het biosysteemversterkingsprogramma in.

Laad de chip in het systeem en voer het programma uit. De resultaten kunnen worden geanalyseerd met fluid dime software om versterkingscurven, hele chip warmtekaarten en CT-waarden voor elk te leveren. Wel met behulp van pre PCR-producten, gezuiverd door groottescheiding op native polyacrylamidegels, wild type DG CR acht en ER null mutant.

RNA werd bereid in vergelijking met eerdere protocollen. Meer microRNA's en een verlies van vals positieve signalen komen voor in zowel DGCR acht null als ER null achtergrond dankzij de zuiveringsstap. Bovendien maakt de gewijzigde QR TPCR R-aanpak de juiste categorisering van zeldzame D gcr acht onafhankelijke dicer-afhankelijke kleine RNA's mogelijk.