Name: Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-16T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Ontdek FRAP om eiwitmobiliteit in dendritische stekels van gekweekte hippocampusneuronen te meten. Deze methode kwantificeert mobiele en immobiele fracties van EGFP voor inzicht in synaptische plasticiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door het National Institute on Doofheid en andere communicatie stoornissen (NIDCD, toont) Intramurale Program.

1. Neuron transfectie <ol><li> Cultuur embryonale dag 18 (E18) rat hippocampale neuronen op poly-d-lysine-gecoate MatTek 35-mm glazen bodem schalen 1. Op 16-18 dagen in vitro (DIV), transfecteren neuronen met behulp van de Clontech CalPhos zoogdieren Transfectie Kit. De eerste, vervang het kweekmedium met 1,5 ml <a href="http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/Cell-Culture/Mammalian-Cell-Culture/Classical_Media/dmem.html">Dulbecco's Modified Eagle Medium</a> (DMEM) per 35 mm schaal 0,5 uur voorafgaand aan transfectie. Bewaar de originele kweekmedium in een steriele 15 ml buis voor later (stap 1.6) te gebruiken. </li><li> Mix 10 microgram pEGFP-N1 plasmide DNA met een steriele H 2 O (Clontech) en 12,4 ul 2 M calcium-oplossing (Clontech) tot een totaal volume van 100 pi. </li><li> Voeg het mengsel van stap 1.2) tot 100 ui 2 × HBS druppelsgewijs terwijl vortexen 2 × HBS met gemiddelde snelheid. </li><li> Laat het mengsel bij kamertemperatuur zitten voor 20 minuten en voeg dan het uiteindelijke mengsel van stap 1.3) in DMEM-bebroede neuronen. </li><li> Leg de neuronen in de 37 ° C incubator voor 1-1,5 uur. </li><li> Verwijder de calcium-fosfaat-bevattende medium, daarna wassen cellen met DMEM drie keer. Voordat de cultuur schotel naar de couveuse, wisselen de DMEM medium met de oorspronkelijke cultuur medium. </li></ol> 2. FRAP experiment op een rug <ol><li> Neuronen zijn gebruikt voor de FRAP experiment twee tot vier dagen na transfectie. </li><li> Vervang het kweekmedium van de 35-mm glas-onderste schaal, door onmiddellijk toe te voegen voorverwarmde Tyrode oplossing, die bevat (in mm) 145 NaCl, KCl 5, HEPES 10, Glucose 10, Glycine 0.005, CaCl 2 2.6, en MgCl 2 1.3 (pH ingesteld op 7,4 met NaOH). </li><li> Een Zeiss LSM 710 confocale microscoop wordt gebruikt voor de FRAP experiment. De Zeiss TempModule systeem wordt gebruikt om de temperatuur (37 ° C), de luchtvochtigheid en de CO 2 (5%) van de werkende systeem te controleren. Zorg ervoor dat de CO 2-tank is aangesloten en de waterfles, die wordt gebruikt voor het balanceren van vocht, is gevuld met water. </li><li> Zoek een volwassen getransfecteerd dendrieten met de 100 × objectief (αplan-APOCHROMAT 100 × / 1,46 olie). Als de getransfecteerde cellen in de schotel zijn schaars, zoeken naar een gewenste cel met de 40 × objectief (plan-NEOFLUAR 40 × / 1,3 olie), en dan overschakelen naar de 100 × doelstelling om beelden vast te leggen. </li><li> Gebruik 5 × optische zoom en een 256 × 256 pixels resolutie van het imago van een kort stukje van de dendriet met diverse stekels. Voor het vastleggen van beelden, gebruik nominale snelheid 9 (pixelverblijftijd 3,15 μsec), die duurt 0,5 seconden tot het einde een scan. De pinhole is ingesteld om 2μm sterke fluorescentie te verkrijgen. Bij het maken van foto's, probeer dan een lage laser transmissie te gebruiken, bijvoorbeeld 1-5%, om te voorkomen dat fotobleken het hele beeld. </li><li> Selecteer de ruggengraat van belang. In ons experiment hebben we gekozen paddestoel stekels met hun rug hoofd diameter van ~ 1 micrometer. </li><li> Om dit te doen een FRAP experiment, neem 5 controle beelden voor het bleken, dan bleek de ruggengraat van de rente 10 keer tegen de nominale 100% laser transmissie [De argon laser vermogen is 30 mW, met 50% (15 MW) in de 488 laserlijn, en ongeveer 3-4 mW bereikt de microscoop door de 488 laserlijn], en vervolgens een reeks beelden vast te leggen direct na het bleken. Voor dit experiment worden de beelden vastgelegd elke 1 seconde voor 15 seconden na het bleken. Het interval van tijd moet worden aangepast op basis van verschillende targeting eiwitten en verschillende experimentele ontwerpen (afb. 1). </li><li> Afbeeldingen opslaan. </li></ol> 3. Data-analyse <ol><li> Open beelden met ImageJ software. </li><li> Plaats de stapel van beelden met behulp van de lijn gereedschap ('plugins' → 'stacks - shuffling' → 'lijn plakken in stack' → 'vertaling' en / of 'starre lichaam') in ImageJ, zodat de wervelkolom van belang niet zweven , met andere woorden - het blijft in dezelfde positie op de afbeelding. </li><li> Meet de relatieve fluorescentie-intensiteit van de wervelkolom van belang (F s), een getransfecteerd maar ongebleekt regio (controle), en een achtergrond regio (F b) in time lapse beelden, met behulp van de 'Intensity v Time Monitor' instrument van ImageJ ("plugins '→' stacks - shuffling '→' Intensity v Time Monitor '). De controle regio kan een stuk van goed gerichte distale dendriet worden. De achtergrond regio is een niet-fluorescerende regio. </li><li> Bereken de fotobleken tarief (r) door vergelijking van de fluorescentie van de controle-regio voor (F c0) en na (F c) fotobleken. r = F c / F c0. </li><li> Normaliseren van de fluorescentie-intensiteit van de doelgroep wervelkolom (F) als volgt: F = (F s - F b) / r. </li><li> Curve passen bij de fluorescentie-intensiteit van het doel wervelkolom met een een-fase exponentiële vergelijking van GraphPad Prism software (fig. 2) of Other soortgelijke software. </li><li> Bereken de mobiele fractie (f m) en de immobiele fractie (f i) door de volgende vergelijkingen: f m = F ∞ / F 0, waar F ∞ is de fluorescentie-intensiteit na volledig herstel, en F 0 is de fluorescentie-intensiteit voor fotobleken. f i = 1 - f m. </li></ol> 4. Representatieve resultaten: In deze studie, voeren we een FRAP experiment op volwassen hippocampus neuronen. Op 18-22 DIV, zijn paddestoel stekels al gevormd. Met behulp van onze methode, kan de dynamische veranderingen van de fluorescentie-intensiteit in een kleine regio, zoals een ruggengraat, worden opgenomen. Voor het analyseren van de fluorescentie herstelproces van EGFP, nemen we 5 foto's als controle voor het bleken en daarna een image elke 1 seconde direct na het bleken gedurende 15 seconden. De resolutie van het beeld is voldoende voor kwantitatieve analyse. De fluorescentie herstel profielen van de fluorescentie gelabelde eiwitten zijn zeer reproduceerbaar. We hebben ook even laten zien hoe je de mobiele en immobiele fracties van een fluorescentie-eiwit, met behulp van ImageJ en GraphPad Prism software te definiëren. De FRAP methode en analyse tonen we hier kan grofweg worden gebruikt in de neurowetenschappen, de celbiologie en andere studies. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. FRAP metingen van EGFP fluorescentie in een rug van een beschaafde hippocampal neuron. De rode pijlen geven de tijd van fotobleken. Foto's vertegenwoordigen hetzelfde gebied voor (Pre) en op 0, 1, 5, 10, 15 seconden na fotobleken. De regio van de wervelkolom, controle-en achtergrond zijn gemarkeerd met letters S, C en B, respectievelijk. Neuronen werden gehandhaafd bij 37 ° C tijdens het experiment. Schaal bar, een urn. <img src="/files/ftp_upload/2568/2568fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. FRAP rondingen van EGFP fluorescentie over een 15-seconden periode. De groene lijn geeft de oorspronkelijke curve, de rode lijn geeft de genormaliseerde curve. De stippen in bochten tonen de FRAP elke 1 seconde. De curven werden gemonteerd door een fase exponentiële vergelijkingen. De gemiddelde fluorescentie voor fotobleken werd geteld als 100%. In dit experiment, de mobiele fractie (MF) is 94% en de immobiele fractie (IF) is 6%.

<ol><li>Zheng, C. Y., Petralia, R. S., Wang, Y. X., Kachar, B., Wenthold, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SAP102+is+a+highly+mobile+MAGUK+in+spines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SAP102 is a highly mobile MAGUK in spines.</a> J Neurosci. 30, 4757-4766 (2010).</li>
<li>Grati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+turnover+of+stereocilia+membrane+proteins%3A+evidence+from+the+trafficking+and+mobility+of+plasma+membrane+Ca%282%2B%29-ATPase+2%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid turnover of stereocilia membrane proteins: evidence from the trafficking and mobility of plasma membrane Ca(2+)-ATPase 2.</a> J Neurosci. 26, 6386-6395 (2006).</li>
<li>Liu, L. N., Aartsma, T. J., Thomas, J. C., Zhou, B. C., Zhang, Y. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+Analysis+on+Red+Alga+Reveals+the+Fluorescence+Recovery+Is+Ascribed+to+Intrinsic+Photoprocesses+of+Phycobilisomes+than+Large-Scale+Diffusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">FRAP Analysis on Red Alga Reveals the Fluorescence Recovery Is Ascribed to Intrinsic Photoprocesses of Phycobilisomes than Large-Scale Diffusion.</a> PLoS ONE. 4, e5295-e5295 (2009).</li>
<li>Wiedenmann, J., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-cell+imaging+with+EosFP+and+other+photoactivatable+marker+proteins+of+the+GFP+family%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Live-cell imaging with EosFP and other photoactivatable marker proteins of the GFP family.</a> Expert Rev Proteomics. 3, 361-374 (2006).</li>
<li>Shaner, N. C., Patterson, G. H., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+fluorescent+protein+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Advances in fluorescent protein technology.</a> J Cell Sci. 120, 4247-4260 (2007).</li>
<li>Sprague, B. L., McNally, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRAP+analysis+of+binding%3A+proper+and+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">FRAP analysis of binding: proper and fitting.</a> Trends Cell Biol. 15, 84-91 (2005).</li>
</ol>

FRAP analyse is algemeen gebruikt in vivo en in vitro studies 1-2. Deze techniek maakt gebruik van het algemeen GFP <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Fusion_protein" title="Fusie-eiwit">fusie-eiwitten</a> , maar het kan ook gebruik maken van rode alg fusie-eiwitten 3. Deze analyse is gevoelig en kan gebruikt worden om de mobiliteit van de GFP-gemerkte eiwitten te karakteriseren. Voor de productie van zinvolle FRAP analyse, is het belangrijk om onnodige fotobleken te vermijden voor en tijdens de FRAP experiment. Er zijn twee manieren om dit te bereiken. Ten eerste moet het proces om te zoeken en te observeren de experimentele neuron te snel. Vooral observatie van neuronen met een 100x objectief voor een lange tijd bleekmiddelen aanzienlijk fluorescentie. Ten tweede, een hoog laservermogen en frequent te scannen vergroten vaak de mogelijkheid van fotobleken. Zo zal het nodig zijn om de fotobleken tarief in een controlegebied vervolgens berekenen en de FRAP curve in de experimentele regio te normaliseren. Het normaliseren methode is beschreven in het protocol (zie stap 3,3-3,5 voor details). De fotobleken stap is ook kritisch voor het waarborgen van goede FRAP resultaten. In dit experiment, we bleekwater de ruggengraat van de rente 10 keer op 100% laser transmissie. Deze voorwaarde is voldoende om het bleken van de fluorescentie van een ruggengraat naar achtergrondniveau in een vaste voorbereiding. Zo zetten we de fluorescentie-intensiteit op hetzelfde aantal als achtergrond op 0 seconden na fotobleken. Afhankelijk van de snelheid van de eerste scan, kan een aanzienlijke hoeveelheid fluorescentie herstel al worden gedetecteerd wanneer het eiwit van belang is zeer mobiel. Veel fluorescerend eiwit probes zijn ontwikkeld voor het eiwit dynamica studie met FRAP. Een aanvullende benadering is, bijvoorbeeld, om te gebruiken fotoactiveerbare GFP (PA-GFP) of photoconvertible varianten. Samen met FRAP techniek worden deze tools steeds onmisbaar voor live cell imaging studies 4-6.

<table><tbody><tr><td>35 mm glazen bodem schaaltjes </td><td>MatTek Corp.</td><td>P35GC-1.0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>CalPhos Mammalian Transfection Kit</td><td>Clontech Laboratories</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>pEGFP-N1 plasmide</td><td>Clontech Laboratories</td><td>6085-1</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss confocale microscoop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>LSM 710</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss TempModule systeem</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td>N.A.</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad Prism software</td><td>GraphPad Software Inc.</td><td>N.A.</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence recovery after photobleaching (frap) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in dendritische stekels van cultured hippocampus neuronen

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) of Fluorescence Tagged Proteins in Dendritic Spines of Cultured Hippocampal Neurons

FRAP is gebruikt om de mobiliteit van GFP-gemerkte eiwitten te kwantificeren. Met behulp van een sterke excitatie laser wordt de fluorescentie van een GFP-gelabelde eiwit gebleekt in de regio van belang. De fluorescentie van de regio zich herstelt wanneer de ongebleekte GFP-gelabelde eiwit van buiten de regio verspreidt in de regio van belang. De mobiliteit van het eiwit wordt vervolgens geanalyseerd door het meten van de fluorescentie recovery rate. Deze techniek kan worden gebruikt om eiwit-mobiliteit en omloopsnelheid te karakteriseren. In deze studie, wij uitdrukking aan de (verbeterde green fluorescent protein) EGFP vector in gekweekte hippocampale neuronen. Met behulp van de Zeiss 710 confocale microscoop, we photobleach de fluorescentie-signaal van het GFP-eiwit in een wervelkolom, en neem dan een time lapse beelden naar de fluorescentie herstel na fotobleken te nemen. Tenslotte, schatten we het percentage van de mobiele en immobiele fracties van de GFP in stekels, door het analyseren van de gegevens met behulp van imaging ImageJ en GraphPad software. Dit FRAP protocol laat zien hoe een basis FRAP experiment uit te voeren, alsook hoe de gegevens te analyseren.

FRAP is gebruikt om de mobiliteit van de groene fluorescentie Protein (GFP)-gemerkte eiwitten in gekweekte cellen te kwantificeren. We hebben de mobiele / immobiele fracties van de GFP onderzocht door het analyseren van de fluorescentie herstel na fotobleken percentage. In deze studie werd uitgevoerd op FRAP stekels van hippocampale neuronen.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen

FRAP is gebruikt om de mobiliteit van GFP-gelabelde eiwitten te kwantificeren. Met behulp van een sterke excitatielaser wordt de fluorescentie van een GFP-gelabeld eiwit gebleekt ...

Het algemene doel van deze procedure is om de mobiliteit van enhanced green fluorescence protein te bepalen door de FRAP van het eiwit in een regio van interesse te meten. Dit wordt bereikt door eerst de EGFP-vector te transfecteren in gekweekte hippocampale neuronen van ratten. Vervolgens wordt de FRAP-opname uitgevoerd in een spine van interesse met behulp van een Zeiss 710 confocale microscoop.De fotobleekrate kan vervolgens worden berekend met behulp van de software Image J en GraphPad Prism. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de mobiliteit van EGFP in een spine van een gekweekt hippocampaal neuron aantonen via confocale microscopie. Dit protocol werd ontwikkeld door Chazen in samenwerking met mijzelf, Ronald Pet, evenals Ya, Wang Bahar Kisha, en de senior auteur van het oorspronkelijke artikel, Robert Ol, die in oktober 2009 is overleden.Wij wijden deze video aan zijn nagedachtenis. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van proteinedynamiek, zoals de omzettingstijd van een specifiek eiwit in een specifiek interessegebied. Begin deze procedure door rat hippocampal neuronen van embryonale dag 18 te kweken op met poly-D-lysine gecoate MatTec 35 millimeter glazen bodemschalen gedurende 16 tot 18 dagen in vitro; transfect de neuronen met de CloneTech CalFoss mammalian transfection kit voordat de transfectie wordt gestart.Bewaar het oorspronkelijke kweekmedium in een steriele buis van 15 milliliter voor later gebruik. Vul elke schaal van 35 millimeter 30 minuten vóór transfectie met 1,5 milliliter DOL eco's modified eagle medium. Combineer vervolgens 10 microgram P-E-G-F-P-N one plasmide-DNA met 12,4 microliter twee molar calciumoplossing en vul het totale volume aan tot 100 microliter met steriel water.Voeg het DNA-mengsel DRUPPELSgewijs toe aan 100 µL tweemaal geconcentreerde HEPES-gebufferde zoutoplossing. Vortex de buffer na elke toegevoegde druppel. Nadat het uiteindelijke mengsel 20 minuten op kamertemperatuur heeft gestaan, voegt u de DNA-bufferoplossing toe aan de in DMEM geïncubeerde neuronen.Incubeer de neuronen bij 37 °C gedurende één tot anderhalf uur. Verwijder na incubatie het medium dat calciumfosfaat bevat uit de kweekschalen en was de cellen met DMEM. Herhaal het wassen met DMEM in totaal drie keer.Vervang het DMEM-medium door het oorspronkelijke kweekmedium voordat de cellen teruggeplaatst worden in de incubator. Neuronen worden twee tot vier dagen na transfectie gebruikt voor het frack-experiment. Vervang ter beginnende fase het kweekmedium in de 35 millimeter glazen bodemschaal onmiddellijk door voorverwarmde Tyro-oplossing.Voor het fractuur-experiment wordt een Zeiss LSM 710 confocale microscoop gebruikt. Het Zeiss temp-modulesysteem handhaaft de temperatuur, de luchtvochtigheid en het percentage kooldioxide van het werksysteem. Controleer of de kooldioxidetank is aangesloten en of de waterfles, die wordt gebruikt voor het balanceren van de luchtvochtigheid, gevuld is met water.Zodra de microscoop is ingesteld, zoek dan met het 100 x objectief naar een getransfecteerde, rijpe dendriet. Als de getransfecteerde cellen in de schaal schaars zijn, zoek dan met het 40 x objectief naar een gewenste cel. Schakel vervolgens over naar het 100 x objectief.Gebruik voor het vastleggen van beelden een vijfvoudige optische zoom en een resolutie van 256 bij 256 pixels. Beeld een kort stuk dendriet met verschillende spines af. Gebruik voor het vastleggen van beelden nominale snelheid negen, wat 0,5 seconden duurt.Om een scan te voltooien, stelt u het pinhole in op twee micrometers om een sterke fluorescentie te verkrijgen. Probeer bij het maken van beelden een lage lasertransmissie te gebruiken, bijvoorbeeld 1 tot 5%, om fotobleken van het gehele beeld te voorkomen. Selecteer vervolgens de dendrietuitloper van belang voor dit experiment.Paddenstoelachtige spines met spinehoofd-diameters van ongeveer één micrometer worden gekozen om een wrap-experiment uit te voeren. Maak vijf controlebeelden voordat er wordt gebleekt, bleek vervolgens de betreffende spine 10 keer bij een nominale lasertransmissie van 100% en leg direct na het bleken een reeks beelden vast. Het tijdsinterval moet worden aangepast aan de verschillende doelwit-eiwitten en verschillende experimentele ontwerpen.Voor dit experiment worden elke seconde beelden vastgelegd gedurende 15 seconden na het bleken. Sla vervolgens de beelden op om de gegevens te analyseren. Open de beelden met Image J-software en richt de stapel beelden uit met de align-tool, zodat het ruggenmerg van belang niet verschuift en in dezelfde positie blijft.Meet op de afbeelding de relatieve fluorescentie-intensiteit van de betreffende spine, wat een getransfecteerd maar niet-gebleekt gebied is. Meet het achtergrondgebied in de time-lapse beelden met de 'intensity versus time'-monitor tool van ImageJ. Gebruik een niet-fluorescerend gebied als achtergrondgebied en pas een curvefit toe op de fluorescentie-intensiteit met een eenfasige exponentiële vergelijking in GraphPad Prism-software of een vergelijkbaar programma. Bereken tot slot het percentage mobiele en immobiele fracties van de fluorescentie.Hier zijn de FRAP-metingen van EGFP-fluorescentie in een dendritische spine van een gekweekte hippocampale neuron. Het gebied van de spine-controle en de achtergrond zijn gemarkeerd, en de rode pijl geeft het tijdstip van fotobleken aan. Foto's van hetzelfde gebied werden gemaakt vóór en op 0, 1, 5, 10 en 15 seconden na het fotobleken.FRA-curven van EGFP-fluorescentie worden weergegeven over een periode van 15 seconden, waarbij de stippen op de curven de FRA per seconde vertegenwoordigen. De curven zijn gefit met eenfasige exponentiële vergelijkingen. De gemiddelde fluorescentie vóór fotobleken werd geteld als 100%. In dit experiment is de mobiele fractie 87% en de immobiele fractie 13%A.Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u de mobiliteit van een GFP-getagd eiwit kunt meten met behulp van de FRAPPE-techniek.

fluorescence-recovery-after-photobleaching-frap-fluorescence-tagged

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In dit artikel beschrijven we de procedure voor het meten van diffusiecoëfficiënten het gebruik van multi-foton fluorescentie herstel na fotobleken. We zullen beginnen met het uitlijnen van de laser langs de optische pad naar het monster en het bepalen van de juiste experimentele parameters, ga dan verder het genereren en tenslotte montage fluorescentie herstel curves.

Het meten van diffusiecoëfficiënten via twee-foton Fluorescence Recovery After Photobleaching

We beschrijven fotobleken methoden, met inbegrip Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) en fluorescentie Loss In Photobleaching (FLIP) om chromatine eiwit dynamiek monitor in embryonale stamcellen (ES) cellen. Chromatine eiwit dynamiek, die wordt beschouwd als een van de middelen om chromatine plasticiteit bestuderen, wordt versterkt in de pluripotente cellen.

Fotobleken Analyses (FRAP &amp; FLIP) om chromatine eiwit Dynamics Meet in Living Embryonale stamcellen

Tal van recente studies hebben aangegeven mutaties in synaptische eiwitten in verband met de hersenen pathologieën. Primaire gekweekte corticale neuronen bieden een grote flexibiliteit in het onderzoeken van de effecten van deze ziekte-geassocieerde eiwitten op dendritische rug morfologie en beweeglijkheid.

Analyse van de dendritische Spine Morfologie in gekweekte CNS Neuronen

Dit rapport beschrijft het gebruik van live cell imaging en photobleach technieken om de oppervlakte-expressie, transportroutes en handel in kinetiek van exogeen uitgedrukt, pH-gevoelige GFP-gelabelde eiwitten in de plasmamembraan van neuronen te bepalen.

Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

We beschrijven het gebruik van styrylkleurstoffen FM kleurstoffen aan het synaptische blaasje recycling in functionele zenuwuiteinden. Dit protocol kan niet alleen opgeroepen, maar ook spontane en miniatuur synaptische activiteiten worden toegepast. Het protocol breidt het aantal synaptische gebeurtenissen die effectief kan worden geëvalueerd.

Onderzoek van de synaptische vesikel Recycling FM Kleurstoffen Tijdens Evoked, Spontaan, en Miniature Synaptic Activiteiten

Synaptic vesikel endocytose is gedetecteerd door de lichte microscopie van pHluorin gefuseerd met synaptic vesikel eiwit en elektronenmicroscopie van vesikel opname.

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Achtergrond autofluorescence van biologische monsters bemoeilijkt vaak fluorescentie gebaseerde beeldvormingstechnieken, vooral in de leeftijd postmitotic weefsels. Dit protocol beschrijft hoe de autofluorescence van deze monsters effectief kan worden verwijderd met behulp van een commercieel beschikbare licht emitterende diode licht het monster vóór immunokleuring photobleach bron.

Eenvoudige verwijdering van achtergrond fluorescentie in formaline-vaste menselijk hersenweefsel voor immunofluorescentie microscopie

We beschrijven hoe micro- en photomanipulation technieken zoals FRAP en photoactivation inschakelen de bepaling van de parameters van de beweeglijkheid en de spatio dynamiek van eiwitten in het migreren van cellen. Experimentele uitlezingen omvatten subcellular dynamiek en omzet van beweeglijkheid toezichthouders of van de onderliggende actine cytoskelet.

Micromanipulation technieken waardoor analyse van morfogenetische dynamiek en een omzet van Cytoskeletal regelgevers

Hier presenteren we een protocol voor het gelijktijdig gebruik van Förster resonance energie overdracht gebaseerde spanning sensoren voor het meten van eiwit belasting en fluorescentie herstel na photobleaching voor het meten van de dynamiek van de eiwitten waardoor de meting van kracht-gevoelige eiwit dynamiek binnen levende cellen.

Meting van de kracht-gevoelige eiwitten Dynamics in levende cellen met behulp van een combinatie van Fluorescent technieken

We beschrijven een uitgebreide en praktische protocol voor fluorescentie herstel na photobleaching experimenten met cellen levende. Hoewel het protocol werd gebruikt voor het meten van de mobiliteit van gele fluorescerende eiwit-gelabeld p62 in aggresome-achtige geïnduceerde structuren, kan het worden toegepast op een verscheidenheid van microscopie systemen en fluorescente proteïnen.

Fluorescentie herstel na Photobleaching van gele fluorescerende eiwit Tagged p62 in Aggresome-achtige geïnduceerde structuren

Ontdek FRAP om eiwitmobiliteit in dendritische stekels van gekweekte hippocampusneuronen te meten. Deze methode kwantificeert mobiele en immobiele fracties van EGFP voor inzicht in synaptische plasticiteit.

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen (Video) | JoVE Journal

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) van de fluorescentie gemerkte eiwitten in Dendritische stekels van Cultured hippocampus Neuronen

Meer video's verkennen