Name: Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-22T18:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer myografie om kracht en vermoeidheid van geïsoleerd skeletspierweefsel bij muizen te meten. Deze methode kwantificeert spierfunctie voor evaluatie van genetische modificaties en therapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door een GGD Grant (HL086513) van NHLBI tot PEO, en een uitgebreide Research Grant van het California Institute for Regeneratieve Geneeskunde (RC1-00104), een Public Health Service Grant (HL085377) van NHLBI, en een gift van de Pollin Stichting HSB SC werd ondersteund door een Californische Instituut voor Regeneratieve Geneeskunde Bridges to Cell Research Award (TB1-01194) naar San Francisco State University Stem.

Het protocol is uitgevoerd met de goedkeuring van de UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC). 1. Dissectie van de muis extensor digitorum longus (EDL) Muscle <ol><li> Voer alle dierlijke procedures in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. </li><li> Euthanaseren van dieren met 200 mg / kg intraperitoneaal pentobarbital / cervicale dislocatie net voor de spieren oogst 10. De dissectie moet zo goed worden beoefend, dat de spier kunnen worden geoogst en gemonteerd in de spanning transducer binnen 15 minuten van euthanasie. </li><li> Schik karkas rugligging op dissectie tray en pin been naar de tray. </li><li> Onder dissectie microscoop, open huid, voorzichtig open fascia (Fig.1A), en de schil tibialis van de enkel naar boven bloot te leggen EDL (Fig.1B). Gebruik druppels Ringerlactaat te houden van de spieren vochtig en gebufferd tijdens de oogst. </li><li> Verwijder de EDL, met behoud van zo veel pees mogelijk op elk uiteinde, en in een petrischaal met Ringer-Lactaat oplossing. Tie hechting aan elk van de pezen van de spieren (Fig.1C). Het is essentieel dat de spiervezels niet worden aangeraakt of gestoord tijdens de dissectie. </li></ol> 2. Montage van de Muis EDL in de Muscle Strip Myograph <ol><li> Voor deze studies, is een weefsel bad nodig die stelt de spier tijdens het op in fysiologische oplossing baden bij constante temperatuur met continue zuurstof. Het bad is gekoppeld aan een krachtopnemer voor het meten van spierspanning. Wij maken gebruik van een geïntegreerd spier strip myograph bad van Deense Myo Technologie (DMT Model 820MS) voor dit doel. Daarnaast worden een vierkant puls elektrische stimulator (Grass Model S48) en data-acquisitie platform (ADInstruments PowerLab Data Acquisition System en LabChart software) die nodig is om te lokken, en opnemen analyseert myo-mechanische reacties, respectievelijk. De DMT 820MS heeft platina-elektroden geïntegreerd in het deksel van die zijn geplaatst aan weerszijden van de spier, in het midden-gedeelte van de spier strip. Andere myographs kunnen vereisen specifieke aandacht voor de plaatsing van de elektroden. </li><li> Vul myograph bad met 5 ml Krebs Henseleit-oplossing 11. Warm tot 25 ° C. Bubble O 2 / CO 2 (95% / 5%) via bad gedurende 15 minuten voorafgaand aan gebruik. </li><li> Gebruik hechtingen aan EDL uit te breiden tussen de klemmen van myograph en de pezen van de EDL spier (Fig.1D, E) veilig tussen de klemmen. Wees voorzichtig dat u de spier zelf klem. </li><li> Handhaaf myograph bad bij 25 ° C. </li></ol> 3. Myo-mechanische analyse A. Twitch spanning <ol><li> Stel de eerste lengte in het bad, zodat er geen spier laksheid. </li><li> Bepaal maximale stimulus (duur 0,5 ms) door het aanpassen van spanning om maximale twitch spanning te verkrijgen, vervolgens stimulus op 20% boven de maximale (tot supramaximale stimulus te bereiken). In onze studies, is het supramaximale stimulus meestal bereikt bij een uitgang van 40 volt. </li><li> Controleer of uitgang van de stimulator met behulp van een oscilloscoop. </li><li> Bepaal optimale lengte door geleidelijk het uitrekken van de spier totdat er geen verdere toename van de twitch spanning. </li><li> Laat spieren in evenwicht gedurende 3 minuten. </li><li> Lever supramaximale vierkante stimulus (0,5 ms) bij optimale lengte met behulp van Grass S44 elektronische stimulator, en opnemen output. </li><li> Record: twitch spanning curve (P t vs tijd; fig. 2a). </li></ol> B. Tetanus spanning <ol><li> Laat spieren rusten gedurende 3 minuten. </li><li> Breng een trein van supramaximale stimuli voor 300msec op 150 Hz op optimale lengte met behulp van Grass S44 elektronische stimulator, en opnemen output. </li><li> Record: tetanus spanning curve (P o vs tijd; Fig.2B). </li></ol> C. Force-frequentie <ol><li> Laat spieren rusten gedurende 3 minuten. </li><li> Force-frequentie: van toepassing treinen van supramaximale stimuli op 30, 60, 100, 140, en 160 Hz met 3 minuten rust tussen elke stimulus (Fig.3). Als alternatief kunnen treinen worden toegepast 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 100, 140 en 160 Hz voor een betere resolutie bij lagere frequenties, waar de kracht verandert aanzienlijk. </li><li> Plot: kracht-frequentie relatie (% maximale kracht vs stimulatie frequentie). </li></ol> D. Vermoeidheid <ol><li> Van toepassing zijn trein van korte tetani: 60 Hz voor 300 ms (of frequentie ingesteld op 50% van de piek kracht produceren), elke 3 seconden gedurende 10 minuten. Met 10 minuten, moet de tetanische kracht dalen tot een plateau niveau van ~ 15% van de oorspronkelijke waarde (Fig.4). </li><li> Plot: lage frequentie vermoeidheid (% maximale kracht vs tijd). </li></ol> E. Aanvullende gegevens verzamelen aan het eind van het protocol <ol><li> Voordat ontkoppelen de spier van de myograph, stelt u de Muscle op optimale lengte, zoals bepaald in stap III.A.4 en meet de diameter met behulp van een oculair op de microscoop of met remklauwen. Bereken doorsnede (um 2). </li><li> Meet spiermassa (mg) door het verwijderen van hechtingen en een gewicht van spieren. </li><li> Weeg de muis om het lichaamsgewicht (g) te beoordelen. </li></ol> 4. Berekeningen <ol><li> Spier: body mass ratio = spiermassa / body mass </li><li> Twitch spanning, P t (mN) = maximale spanning die tijdens twitch </li><li> Specifieke twitch spanning (N / cm 2) = twitch spanning (mN) / doorsnede (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 </li><li> Tijd om piek spanning (ms) = de tijd vanaf het begin van de contractie om een ​​maximale spanning </li><li> Half-relaxatietijd (ms) = tijd van piek spanningen tot 50% van de piek spanning </li><li> Tetanische spanning, P O (MN) = maximale spanning die tijdens tetanus </li><li> Specifieke tetanische spanning (N / cm 2) = tetanische spanning (mN) / doorsnede (um 2) x 10 5 N / mN • um 2 / cm 2 </li><li> Maximale snelheid van de stijging van tetanus (N / s) = maximumpercentage van de stijging van de spanning tijdens de spanning stijging van tetanus, dat wil zeggen, de maximale helling van de tetanische spanning curve (of, dP O / dt) </li><li> Half-relaxatie tetanische spanning (ms) = tijd van beëindiging van stimulatie tot 50% van de spanning bij beëindiging van de stimulatie </li><li> Twitch spanning-to-tetanische spanning ratio, P t / O = P maximale twitch spanning / maximale tetanische spanning </li><li> Vermoeidheid index = verhouding van de spanning na twee minuten met een lage frequentie vermoeidheid tot maximale isometrische spanning </li></ol> 5. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Dissectie van EDL spier. A, Blootstelling van achterbeen muscles.TA, tibialis anterior. B, Blootstelling van EDL (extensor digitorum longus) spier. C, Bevestigen van hechtingen aan EDL pezen. D, Tension transducer bad (view van de zijkant). E, EDL gemonteerd in bad (bovenaanzicht). De spier in onvolledig ondergedompeld in de buffer voor illustratieve doeleinden, in de praktijk, de spier moet volledig worden ondergedompeld om te voorkomen dat uitdroogt. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Voorbeeld van spanning bochten. A, voorbeeld van de twitch spanning curve illustreert maximale twitch spanning (P t), contractie tijd (CT) en de half-relaxatietijd (HRT). Bar, 1s. B, Voorbeeld van tetanische spanning lijn die de maximale tetanische spanning (P o) en half-relaxatie tetanische spanning (HRTT). Bar, 1s. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig3.jpg" alt="Figuur 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 3"> Figuur 3. Voorbeeld van een kracht-frequentie-relatie-analyse. A, spanningen opgewekt door incrementele stimulatie frequenties. B, Voorbeeld van een puls trein op 30MHz. Bar, 80ms. C, Voorbeeld van een puls trein op 140MHz. Bar, 80ms. D, Voorbeeld van een kracht-frequentie curve afgeleid uit gegevens in A. De vorm van de kracht-frequentie curve is kenmerkend voor spierkracht, en kan worden vergeleken tussen de spieren van verschillende dieren. <img src="/files/ftp_upload/2582/2582fig4.jpg" alt="Figuur 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 4"> Figuur 4. Voorbeeld van een lage frequentie vermoeidheid-analyse. A, afnemende spanningen opgewekt over periode van lage frequentie stimulation.Examples van pulsreeksen bij bepaalde tijdstippen (B, C, D) worden hieronder weergegeven. E, Voorbeeld van een lage frequentie vermoeidheid curve afgeleid uit gegevens in A. De vorm van de lage frequentie vermoeidheid curve is kenmerkend voor spierkracht, en kan worden vergeleken tussen de spieren van verschillende dieren.

<ol><li>Harcourt, L. J., Schertzer, J. D., Ryall, J. G., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+dose+formoterol+administration+improves+muscle+function+in+dystrophic+mdx+mice+without+increasing+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscul+Disord%22%5BJournal%5D)">Low dose formoterol administration improves muscle function in dystrophic mdx mice without increasing fatigue.</a> Neuromuscul Disord. 17, 47-55 (2007).</li>
<li>Messina, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+overexpression+via+adeno-associated+virus+gene+transfer+promotes+skeletal+muscle+regeneration+and+enhances+muscle+function+in+mdx+mice%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">VEGF overexpression via adeno-associated virus gene transfer promotes skeletal muscle regeneration and enhances muscle function in mdx mice.</a> FASEB J. 21, 3737-3746 (2007).</li>
<li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine+1-phosphate+protects+mouse+extensor+digitorum+longus+skeletal+muscle+during+fatigue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sphingosine 1-phosphate protects mouse extensor digitorum longus skeletal muscle during fatigue.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 288, C1367-C1373 (2005).</li>
<li>MacIntosh, B. R., Willis, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-frequency+relationship+and+potentiation+in+mammalian+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Force-frequency relationship and potentiation in mammalian skeletal muscle.</a> J Appl Physiol. 88, 2088-2096 (2000).</li>
<li>Hayes, A., Williams, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+clenbuterol-treated+mdx+muscle+are+enhanced+by+low-intensity+swimming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of clenbuterol-treated mdx muscle are enhanced by low-intensity swimming.</a> J Appl Physiol. 82, 435-439 (1997).</li>
<li>Coulton, G. R., Curtin, N. A., Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mdx+mouse+skeletal+muscle+myopathy%3A+II.+Contractile+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathol+Appl+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The mdx mouse skeletal muscle myopathy: II. Contractile properties.</a> Neuropathol Appl Neurobiol. 14, 299-314 (1988).</li>
<li>Danieli-Betto, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+alpha-sarcoglycan+differently+affects+fast-+and+slow-twitch+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Deficiency of alpha-sarcoglycan differently affects fast- and slow-twitch skeletal muscles.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 289, R1328-R1337 (2005).</li>
<li>Chan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene+for+speed%3A+contractile+properties+of+isolated+whole+EDL+muscle+from+an+alpha-actinin-3+knockout+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">A gene for speed: contractile properties of isolated whole EDL muscle from an alpha-actinin-3 knockout mouse.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 295, C897-C904 (2008).</li>
<li>Personius, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grip+force%2C+EDL+contractile+properties%2C+and+voluntary+wheel+running+after+postdevelopmental+myostatin+depletion+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl%22%5BJournal%5D)">Grip force, EDL contractile properties, and voluntary wheel running after postdevelopmental myostatin depletion in mice.</a> J Appl. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Curr Protoc Immunol. Chap 1, (2006).</li>
<li>Beekley, M. D., Wetzel, P., Kubis, P., Gros, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+properties+of+skeletal+muscle+fibre+bundles+from+mice+deficient+in+carbonic+anhydrase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Contractile properties of skeletal muscle fibre bundles from mice deficient in carbonic anhydrase II.</a> Pflugers Arch. 452, 453-463 (2006).</li>
</ol>

Beschrijven we een gedetailleerde benadering van de evaluatie myo-mechanische eigenschappen in geëxplanteerd achterbeen spieren van de muis. De EDL, terwijl moeilijker te ontleden vanwege de achterste positie achter de tibialis anterior spier, is gemakkelijker te beoordelen dan de tibialis anterior vanwege zijn prominente tendineuze bijlagen aan de enkel-en kniegewrichten. Deze pezen voor montage in de spier strip myograph. In tegenstelling tot de meer gemakkelijk bereikbaar tibialis anterior heeft een brede, bijna atendinous gehechtheid aan het kniegewricht, waardoor het buitengewoon moeilijk om zowel ontleden, zonder afbreuk te doen aan de spier, en veilig monteren in de myograph. We wijzen er ook op dat snel monteren van de spier in een zuurstofrijke bad in fysiologische buffer en de temperatuur is essentieel voor het behoud van de spieren van de mechanische eigenschappen. We hebben ontdekt dat we deze analyse herhalen voor maximaal 30 minuten zonder significante veranderingen in de spieren reactie onder deze omstandigheden. Tot slot is het essentieel dat de spiervezels niet worden aangeraakt tijdens de dissectie en montage procedures, omdat dit nadelige gevolgen kunnen hebben op de spierfunctie, en leiden tot onderschatting van myo-mechanische kracht. Door het volgen van deze procedures, deze analyse biedt een robuuste kwantitatieve benadering van de evaluatie van de effecten van genetische modificatie op de spierfunctie 6,7,8,9, evenals vergelijking tussen de therapeutische interventies in muismodellen van spierziekte 1,2,3,5 .

Oplossingen en Media Ringer-Lactaat oplossing <ul><li> 100 mM NaCl </li><li> 30 mM CH3CH (OH) COONa (natrium lactaat) </li><li> 4 mM KCl </li><li> 1 mM CaCl 2 2H 2 O (calcium chloride dihydraat) <ul><li> de pH instellen op 6,75 </li></ul></li></ul> Krebs Henseleit oplossing <ul><li> 118 mM NaCl </li><li> 4,7 mM KCl </li><li> 1,25 mM CaCl 2 </li><li> 1.2 mM MgCl 2 </li><li> 1,2 mM KH 2 PO 4 </li><li> 25 mM NaHCO 3 </li><li> 11 mM glucose <ul><li> breng de pH op 7,2-7,4 door equilibreren met O 2 / CO 2 (95% / 5%) gas </li></ul></li></ul> Pentobarbital <ul><li> 5 mg / ml werkoplossing in steriel water </li></ul>

myo-mechanische analyse van geïsoleerde skeletal muscle

Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

Om de in vivo effecten van therapeutische interventies voor de behandeling van spierziekte 1,2,3, zijn kwantitatieve methoden nodig die maatregel de troepenmacht en de vermoeidheid in de behandelde spier. Beschrijven we een gedetailleerde benadering van de evaluatie myo-mechanische eigenschappen in vers geëxplanteerd achterbeen spieren van de muis. We beschrijven de atraumatische oogst van de muis extensor digitorum longus, de montage van de spier in een spier strip myograph (Model 820MS; Deense Myo Technology), en de meting van de maximale twitch en tetanische spanning, samentrekking tijd, en half-relaxatie tijd, met behulp van een square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Met behulp van deze metingen, tonen we de berekening van de specifieke twitch en tetanische spanning genormaliseerd naar spier dwarsdoorsnede, de twitch-to-tetanische spanning ratio, de kracht-frequentie relatie curve en de lage frequentie curve vermoeidheid 4. Deze analyse biedt een methode voor kwantitatieve vergelijking tussen de therapeutische interventies in muismodellen van spierziekte 1,2,3,5, evenals de vergelijking van de effecten van genetische modificatie op de spierfunctie 6,7,8,9.

Voor de beoordeling van de<em&gt; In vivo</em&gt; Effecten van therapeutische interventies voor spier-en vaatziekten, zijn methoden nodig om de troepenmacht en de vermoeidheid in de behandelde spier kwantificeren. We detail een methode om te beoordelen myo-mechanische eigenschappen in geëxplanteerd muis achterbeen spieren. Deze analyse geeft een robuuste aanpak ontwikkelen om kwantificeren van de effecten van genetische modificatie op de spierfunctie, evenals de vergelijking van therapieën in muismodellen van spierziekte.

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

Om de in vivo effecten van therapeutische interventies voor de behandeling van spierziekten 1,2,3 te beoordelen, zijn kwantitatieve methoden nodig die de kracht meten ...

Het doel van deze procedure is om de gegenereerde kracht en de vermoeibaarheid van geïsoleerde skeletspieren te bepalen, als methode om de effecten van genetische modificatie of therapie te kwantificeren. Eerst wordt de musculus extensor digitorum longus gedissekeerd uit de achterpoot van de muis. Vervolgens wordt de spier gemonteerd in een muscle strip myo.De volgende stap is het vaststellen van de spanning voor stimulatie en de voorspanning van de spier waarbij de maximale twitchspanning wordt bereikt. De laatste stap is het bepalen van de kracht-frequentierelatie van de spier, evenals het begin en de mate van vermoeidheid bij stimulatie met een lage frequentie tot aan een tetanische contractie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die meetbare veranderingen in de mechanische eigenschappen van de spier aantonen via myografie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals inspanningstesten, is dat myografie een kwantitatieve beoordeling van de spierkracht en -functie mogelijk maakt. We hebben deze methode voor het eerst geïmplementeerd toen we beseften dat kwantitatieve maten voor het beoordelen van de spierfunctie nodig zijn bij het testen van nieuwe cel- en bio-engineeringgebaseerde therapieën voor spierziekten in preklinische diermodellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het veld van de spierbiologie en spierdystrofie, zoals de vraag of specifieke therapieën of genetische modificaties de spierfunctie beïnvloeden.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de stappen die nodig zijn om de spieren correct te hanteren moeilijk onder de knie te krijgen zijn. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben, omdat een snelle, niet-traumatische dissectie van de achterpotesspieren oefening en verworven vaardigheid vereist. De procedure wordt gedemonstreerd door een onderzoeker en een promovendus uit onze laboratoria.Plaats na euthanasie van een muis het karkas met de buikzijde naar boven op een dissectiebakje en zet het pootje met spelden op het bakje vast onder een dissectiemicroscoop. Snijd de huid open en open voorzichtig de fascia. Pel vervolgens de musculus tibialis anterior vanaf de enkel naar boven om de musculus extensor digitorum longus of EDL-spier bloot te leggen.Gebruik druppels lactaat-Ringer-oplossing om de spier vochtig te houden tijdens de oogst. Dissekeer vervolgens de EDL terwijl zoveel mogelijk pees aan beide uiteinden behouden blijft, en let erop de EDL-spiervezels zelf niet aan te raken. Plaats de EDL-spier in een Petrischaal met lactaat-Ringer-oplossing.Knoop nu hechtingen vast aan elk van de spiertendons. In deze studies wordt een weefselbad gebruikt om de spier vast te houden en een krachttransducer om de spierspanning te meten. Daarnaast worden een elektrische stimulator voor vierkantgolven en een platform voor gegevensverwerving gebruikt om mechanische reacties op te wekken, te registreren en te analyseren.De volgende stap is om het bad voor het spiertransplantaat te vullen met 6,5 milliliters Krebs-oplossing, oftewel de satellietoplossing. Warm het bad op tot 25 °C en belucht de Krebs-oplossing met 95% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Laat de oplossing 15 minuten beluchten. Gebruik hechtingen op de pezen om de EDL-spier naar het bad over te brengen.Bevestig de pezen tussen de klemmen van het myo-transplantat. Pas op dat u niet de spier zelf klemt. Houd het myo-transplantatbad op 25 °C.Om te beginnen met de spanningsanalyse, dient de initiële spierlengte zo te worden aangepast dat deze gelijk is aan de inci spierlengte. Gebruik een stimulusduur van 0,5 milliseconden. Verhoog de spanning geleidelijk om de stimulus te bepalen die nodig is om de maximale twitchspanning te verkrijgen.Stel vervolgens de stimulus 20% hoger in om een supramaximale stimulus te bereiken, wat gewoonlijk ongeveer 40 volt is. De volgende stap is om de spier geleidelijk te rekken totdat er geen verdere toename in de twitch-spanning meer optreedt. Deze lengte wordt beschouwd als de optimale spierlengte.Laat de spier drie minuten equilibreren en houd de spier vervolgens op zijn optimale lengte. Dien een supramaximale vierkante stimulus toe en registreer de output; registreer de twitch-spanningscurve. In deze figuur.De maximale twitchspanning is aangeduid als pt. De contractietijd is aangeduid als ct. De halve relaxatietijd is aangeduid als HRT.De balk stelt één seconde voor na een rustperiode van drie minuten. Meet de titanische spanning door een reeks supermaximale stimuli toe te passen gedurende 300 milliseconden bij 150 hertz bij optimale lengte. Deze procedure genereert een tetanusspanningscurve.De maximale titanische spanning wordt aangeduid als po. De half-relaxatie titanische spanning wordt aangeduid als HRTT. De balk vertegenwoordigt één seconde na een rustperiode van drie minuten.Begin de kracht-frequentieanalyse door stimulatiesreeksen van 300 milliseconden met supermaximale stimuli toe te passen bij 30, 60, 100, 140 en 160 hertz. Las na een rustperiode van drie minuten telkens drie minuten rust in tussen elke reeks stimuli. Begin de vermoeidheidsanalyse door gedurende 10 minuten elke drie seconden stimulatiesreeksen van 60 hertz voor 300 milliseconden toe te passen.De tetanuskracht moet afnemen tot een plateauniveau van ongeveer 15% van de beginwaarde. Na het voltooien van de krachtmetingen met de spier op optimale lengte, dient de spierdiameter te worden gemeten met het oculair van de microscoop. Verwijder vervolgens de hechtingen en weeg de spier om de spiermassa te bepalen.De laatste stap is om de muis te wegen om de lichaamsmassa te bepalen. Deze metingen worden gebruikt voor de berekeningen die in het bijbehorende artikel worden beschreven. Deze figuur toont de toename van de gegenereerde spanning bij de getoonde toenemende stimulusfrequenties.Hier is de respons van de spier op een pulstrein van 30 hertz. Deze figuur toont de grotere kracht die wordt opgewekt bij een pulstrein van 140 hertz. Deze grafiek toont de kracht-frequentierelatie, uitgezet als het percentage van de maximale kracht tegenover de stimulatiefrequentie.De vorm van de kracht-frequentiecurve is kenmerkend voor de spierkracht en kan worden gebruikt om vergelijkingen te maken tussen spieren van verschillende dieren. Deze figuur demonstreert spiervermoeidheid gedurende 10 minuten stimulatie met een lage frequentie. Deze figuren tonen de respons van de spier op de stimulusreeks op de aangegeven tijdstippen.Deze grafiek toont de spiervermoeidheid bij lage frequentie als een percentage van de maximale kracht tegenover de tijd. De vorm van de curve voor vermoeidheid bij lage frequentie is kenmerkend voor de spierkracht en kan worden gebruikt om vergelijkingen te maken tussen spieren van verschillende dieren. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in 30 minuten worden uitgevoerd door deze procedure te volgen.Andere methoden zoals immunohistochemie, western blot en kwantitatieve PCR kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of en in welke mate specifieke myogene eiwitten en stamcelmarkers tot expressie komen in de behandelde spier tijdens deze procedure. Het is belangrijk om alle apparatuur klaar te hebben staan om de tijd tussen de oogst van de spier en de analyse te minimaliseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de achterpoot van de spier moet dissekeren, de spier moet monteren in een muscle strip myometer, zoals die van Danish Myo Technology die we u hebben getoond, en hoe u veranderingen in de mechanische eigenschappen kunt meten.

myo-mechanical-analysis-of-isolated-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

We beschrijven een methode om direct te meten spierkracht, spierkracht, contractiele kinetiek en vermoeidheid van geïsoleerde skeletspieren in...

Ex Vivo Beoordeling van contractiliteit, vermoeidheid en alternantie in geïsoleerde skeletspieren

Spierfunctie metingen bijdragen tot de evaluatie van potentiële therapeutische middelen voor spier pathologie, evenals de bepaling van mechanismen fysiologie van dit weefsel. We zullen aantonen de voorbereiding van de m. extensor digitorum longus en het middenrif spieren voor functionele testen. Protocollen voor isometrische en excentrische contracties zal worden getoond, evenals de verschillen in resultaten tussen dystrofische spieren, wat neerkomt op een pathologische toestand, en wildtype...

Isometrische en Excentrische troepenmacht Beoordeling van skeletspieren Geïsoleerd van muizenmodellen van spierdystrofieën

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Zebravis zijn een opkomende systeem voor het modelleren van menselijke aandoeningen van de skeletspieren. We beschrijven een snelle en efficiënte methode om skeletspier myovezels isoleren van embryonale en larvale zebravis. Deze methode levert een high-density myofiber voorbereiding geschikt voor onderzoek met een enkelvoudige skeletspieren vezelmorfologie, eiwit lokalisatie, en spier-fysiologie.

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

Individuele cardiomyocyten van wilde type en mutante muizen kunnen uit het hart worden geïsoleerd om hun contractiliteit en calciumtransienten te bestuderen. Dit maakt het mogelijk om de bijdrage van cellulaire disfunctie aan hartdisfunctie, van welke oorzaak dan ook, te karakteriseren.

Isolatie en fysiologische analyse van de Muis Cardiomyocyten

Analyse van de contractiele eigenschappen van chemisch huid of doorlaatbaar gemaakt, skeletspier vezels een krachtig middel om spierfunctie beoordeeld op het niveau van de interne spiercel. In dit artikel schetsen we een valide en betrouwbare techniek bereid en getest doorlaatbaar skeletspier vezels in vitro.

Meting van de maximale isometrische kracht die door gepermeabiliseerd Skeletal Muscle Vezels

Hier gepresenteerd is een protocol om de contractiele eigenschappen van gestreepte spier myofibrils met nano-Newton resolutie te beoordelen. Het protocol maakt gebruik van een setup met een interferometrie-gebaseerde, optische kracht sonde. Deze opstelling genereert gegevens met een hoge signaal-ruisverhouding en maakt de beoordeling van de contractiele kinetiek van myofibrils mogelijk.

Myofibrils isoleren van skeletspierbiopten en het bepalen van contractielfunctie met een Nano-Newton Resolution Force Transducer

Dit technische rapport beschrijft een variatie van de gewijzigde Bergström techniek voor de biopsie van de musculus tibialis voorste die vezelschade beperkt.

Verzameling skeletspierbiopten uit het superieure compartiment van human musculus Tibialis Anterior voor mechanische evaluatie

De skeletspierfunctie kan worden beoordeeld door de contractiliteit van geïsoleerde spiervezels te kwantificeren, traditioneel met behulp van bewerkelijke benaderingen met een lage doorvoer. Hier beschrijven we een op optica gebaseerde, high-throughput methode om de contractiliteit van hydrogel-ingebedde spiervezels te kwantificeren. Deze aanpak heeft toepassingen voor geneesmiddelenscreening en therapeutische ontwikkeling.

High-throughput contractiele metingen van hydrogel-ingebedde intacte muisspiervezels met behulp van een op optica gebaseerd systeem

We beschrijven een protocol om enzymatisch gedissocieerde vezels van verschillende lengtes en typen te verkrijgen uit zes spieren van volwassen muizen: drie daarvan zijn al beschreven (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) en drie van hen zijn voor het eerst met succes gedissocieerd (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

Intacte korte, tussenliggende en lange skeletspiervezels verkregen door enzymatische dissociatie van zes achterpootspieren van muizen: voorbij flexor digitorum brevis

Dit protocol beschrijft de isolatie van intacte enkele spiervezels uit de oxidatieve soleus en het vestigen van sterk gezuiverde myoblastculturen afkomstig van deze vezels. De geoptimaliseerde procedure levert betrouwbaar ongeveer 300–500 intacte myovezels per muis op, waardoor downstream moleculaire en cellulaire analyses mogelijk zijn.

Isolatietest voor één vezel voor de beoordeling van oxidatieve myovezelgedrag

Leer myografie om kracht en vermoeidheid van geïsoleerd skeletspierweefsel bij muizen te meten. Deze methode kwantificeert spierfunctie voor evaluatie van genetische modificaties en therapieën.

Myo-mechanische analyse van geïsoleerde Skeletal Muscle

Meer video's verkennen