Name: Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Leer microarray-analyse met RNA-isolatie, cDNA-synthese en biotin-markering voor Saccharomyces cerevisiae. Deze methode toont genexpressieveranderingen bij oxidatieve stress aan studenten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<p class="jove_content"&gt; University of Vermont, Vermont Genetics Network. Deze publicatie is mogelijk gemaakt door de Vermont Genetics netwerk, door middel van Grant Aantal P20 RR16462 uit het BRIN-programma en Grant Aantal P20 RR16462 uit de INBRE Programma van theNational Center for Research Resources (NCRR), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH) . De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigen niet noodzakelijk de officiële standpunten van NCRR of NIH.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; We zouden graag al onze deelnemende outreach instellingen bedanken voor hun medewerking en inzet bij het verfijnen van deze module Castleton State College, Green Mountain College, Johnson State College, Lyndon State College, Marlboro College, Middlebury College, Norwich University en Saint Michael&#39;s College.</p&gt;

<ol><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).</li>
<li>Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+responses+to+oxidative+stress+impact+upon+multiple+levels+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis.</a> J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).</li>
<li>Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H2O2+stimulon+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).</li>
<li>Vermont Genetics Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microarray+Outreach%22">Microarray Outreach</a>. , (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Affymetrix+GeneChip+Expression+Analysis%3A+Technical+Manual%22">Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual</a>. , Affymetrix. Santa Clara, CA. (2004).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+Bioinformatics+Resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.</a> Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAVID%3A+Database+for+Annotation%2C+Visualization%2C+and+Integrated+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery.</a> Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).</li>
</ol>

De productie van deze video-artikel werd gesponsord door EMD-Millipore.

<p class="jove_step"&gt; Toepassingen en betekenis.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; The Vermont genetica Network outreach-programma, aan de Universiteit van Vermont, voert undergraduate outreach tot acht partner baccalaureaat universiteiten in heel de staat. Het doel van de VGN Outreach Core is om studenten bloot te leggen in de staat Vermont om state-of-the-art wetenschappelijke technologie en bronnen met behulp van hands-on ervaringen. De beschreven microarray-module is ontwikkeld in 2003 en latere. Het is aangeboden als een mini-cursus of geïntegreerd in het bestaande curriculum laboratorium aan de deelnemende instellingen.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Dit project, tussen de universiteit kernen en undergraduate colleges, bevordert de samenwerking in onderwijs en onderzoek. Microarray outreach in de staat heeft verbeterd curriculum en creëerde onderzoeks-en netwerkmogelijkheden voor kernfaciliteiten, docenten en studenten.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Als undergraduate faculteit goedkeuring van het programma worden zij aangemoedigd om uniek experiment ontwerp, mits er geschikt Affymetrix GeneChips en annotatie beschikbaar. Alle informatie voor deze module inclusief het laboratorium handleiding, referenties en PowerPoint-presentaties zijn online beschikbaar (Vermont Genetica Network, 2008).</p&gt;<p class="jove_step"&gt; Kritische stappen:</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Spheroplasting:</em&gt; Het is belangrijk om een ​​succesvolle spheroplasting waarnemen onder de microscoop. Het gebruik van SDS is zeer nuttig zijn, omdat zorgt ervoor dat de gist zwelling wat resulteert in sferoïden. Het is belangrijk te constateren dat de ontluikende cellen sferoïden vorm ook. Als gedeeltelijke spheroplasting wordt waargenomen, wordt een langdurige behandeling met lyticase aanbevolen.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Pellet reiniging:</em&gt; Tijdens de neerslag en de daaropvolgende reactie van ethanol wasstap, is het heel gemakkelijk om te verliezen van de cDNA pellet. Uiterste zorg en nauwgezette aandacht voor de pellet is noodzakelijk.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Toepassing van de water naar het midden van het membraan:</em&gt; Tijdens de RNA-elutie stap van het membraan, is het belangrijk om &quot;spuiten&quot; het 30 ul van het water rechtstreeks naar het centrum van het silica membraan. Als dit niet bereikt, kan de kolom worden gecentrifugeerd en de daaruit voortvloeiende elutant kan opnieuw worden toegepast op de silica membraan opnieuw. Dit kan worden herhaald zo vaak als nodig is.</p&gt;<p class="jove_step"&gt; Wijzigingen en Product Vervangingen:</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Alternatieve RNA clean-up kolommen kunnen worden vervangen. Voorbeelden hiervan zijn de USB-prep-gemak en de Invitrogen Pure Link RNA kit, en de Omega RNA clean-up kit om een ​​paar te noemen.</li&gt;<li&gt; Schizosaccharomyces pombe is een optionele gist. De Affymetrix GeneChip bevat zowel genoom op dezelfde chip</li&gt;<li&gt; Diverse behandelingen en tijden kunnen worden gebruikt. Dit kan onder andere medicamenteuze behandelingen, temperatuur behandelingen, anti-oxidanten, etc. De behandeling tijden kunnen ook worden aangepast.</li&gt;<li&gt; DNase behandeling kan niet worden verplicht, omdat de beschreven methoden gebruiken het gebruik van een oligo (dT) primer.</li&gt;<li&gt; Het is niet verplicht om een ​​dubbele elutie van het RNA uit de kolom met dezelfde 30 ul aliquot uit te voeren. Once is bijna altijd voldoende. Dit wordt voorgesteld om te verzekeren dat een volledig herstel wordt verkregen. Bovendien, het water wordt gebruikt om de RNA-elueren uit de kolom kan voorverwarmd worden tot 65 ° C tot verdere versterking van de capaciteit om RNA te herstellen van de silica kolom.</li&gt;<li&gt; Veel methoden zijn beschikbaar om RNA te kwantificeren. De Eppendorf-en Nanodrop zijn alleen geselecteerd op hun gebruiksgemak en geteste nauwkeurigheid.</li&gt;<li&gt; Agarosegelelektroforese veel worden uitgevoerd met behulp van standaard laboratoriumapparatuur. De E-Gel is niet verplicht, maar is wenselijk omdat het RNase gratis en vereist geen gel stollen wachttijd.</li&gt;<li&gt; Bestellen informatie voor producten is geleverd. Echter, vele algemene reagentia te bestellen van meerdere leveranciers.</li&gt;<li&gt; Een Cycle cDNA reagentia kan afzonderlijk worden aangeschaft, indien dat meer is kosteneffectief.</li&gt;<li&gt; Er zijn andere doelgroepen prep methoden, maar wij vinden dit een biedt meer onderwijs kansen voor de student.</li&gt;</ol&gt;

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Algemeen Laboratory Equipment</strong</td<td<strong&gt; Bedrijf</strong</td<td<strong&gt; Product nummer</strong</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Spetrophotometer</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermocyler</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Reactievaatjes</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vortex</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Roer Platen (2)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-10s pipetten</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-20&#39;s pipetten:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-200&#39;s pipetten:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-1000&#39;s pipetten:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Camera en transilluminator</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Supplies - aanbevolen</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E-Gel Apparatuur</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6000-08</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E-Gels</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6018-02</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 1,7 ml. Duidelijk</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT175C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 0,5 ml helder buizen</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT060C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 2ml vast te leggen buizen</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT200NC</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dozen van P-10 ART tips:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT10XL</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dozen van P-100 ART tips:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT200</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dozen van P-20 ART Tips:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT20</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Dozen van P-1000 ART Tips:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT1000</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gist Chips</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Algemeen Laboratory Supplies</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 25 ml steriele disposable pipetten-</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5 ml steriele disposable pipetten-</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microfugebuisje racks</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KimWipes:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lab Coats</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Roer Bars</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cultuur kolven</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Innoculating loops</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sharpies</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Handschoenen</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Autoclaaf tape</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Roerwerk bars</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagentia</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 30% waterstofperoxide</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-386790?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 386.790</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HBSS zonder Ca, Mg, of kleurstof</td<td&gt; Sigma-Aldrich</td<td&gt; H6648-100ml</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen RNeasy Mini Kit:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 74104</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen DNase Kit:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 79254</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; RNase Remover</td<td&gt; Denville Wetenschappelijk</td<td&gt; D1180</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Harleco Alcohol 100%</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/harleco-alcohol/EMD_CHEM-65347/p_uuid?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 65347</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ENZO IVT Kit</td<td&gt; ENZO</td<td&gt; ENZ-42655-10</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lyticase: een fles</td<td&gt; VWR</td<td&gt; IC19012310</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Water, Cell Culture kwaliteit</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4.86505?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4,86505</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Gist cultuur:</td<td&gt; ATCC</td<td&gt; 18824</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YPD bouillon poeder</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/products/EMD_CHEM-4.85040?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4.8504</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; D (+) Glucose, watervrij</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-346351?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 346.351</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sorbitol</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-56755?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 56755</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EDTA</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4005?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4005</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SDS-oplossing, 20%</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-7990-OP?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 7990-OP</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pellet Paint</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69049?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69049</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PCI RNase DNase vrij (7 porties):</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; AC32711-500</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7,5 m NH4OAc</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; ICN1987 5980</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fragmentatie buffer (200 mM Tris-acetaat, pH 8,1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Trizma Base</td<td&gt; Fiaher</td<td&gt; 50-899-90034</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KOAc</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; NC9757725</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgOA</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; NC9681042</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Laden met Dye</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; 10482055</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PCR Markers</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69278-3?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69278-3</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Phase Lock Gels</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; FP2302820</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Een-Cycle cDNA Kit</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; A10752-030</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Inclusief;</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. coli DNA Pol</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNTP&#39;s</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; T4 DNA Pol.</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; T-7 oligod (T)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0,5 ml EDTA pH 8,0</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Eerste Strand Buffer</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. Coli RNaseH</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tweede Strand Buffer</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. Coli-DNA-ligase</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SuperScript II</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DTT</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

microarray analyse voor saccharomyces cerevisiae</em

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In dit protocol is genexpressie in gist (Saccharomyces cerevisiae) veranderde na de blootstelling aan oxidatieve stress veroorzaakt door de toevoeging van waterstofperoxide (H 2 O 2), een oxidatiemiddel. In het experiment, is gist gekweekt voor 48 uur in 1/2X YPD bouillon met 3X glucose. De cultuur is verdeeld in een controle en behandelde groep. Het experiment cultuur is behandeld met 0,5 mm H 2 O 2 in Hanks gebufferde fysiologische zoutoplossing (HBSS) gedurende 1 uur. De controle cultuur is behandeld met HBSS alleen. Totaal RNA wordt gewonnen uit beide culturen en wordt omgezet in een biotine-gelabeld cRNA product door middel van een complex proces. Het uiteindelijke synthese product wordt teruggenomen naar de UVM Microarray Core Facility en gehybridiseerd met de Affymetrix gist GeneChips. De resulterende genexpressie gegevens worden geüpload naar bio-informatica data-analyse software.

In dit protocol, genexpressie in gist (<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;) Wordt gewijzigd na blootstelling aan oxidatieve stress veroorzaakt door de toevoeging van waterstofperoxide (H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt;), Een oxidatiemiddel.

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

In dit protocol wordt de genexpressie in gist (Saccharomyces cerevisiae) gewijzigd na blootstelling aan oxidatieve stress, geïnduceerd door de toevoeging van waterstof...

Het algemene doel van deze procedure is om studenten in de bachelorwetenschappen kennis te laten maken met microarray-technologie door de expressieverschillen te bestuderen in gist die wordt blootgesteld aan oxidatieve stress. Dit wordt bereikt door eerst totaal RNA te isoleren uit gistculturen die zijn behandeld met waterstofperoxide en uit de onbehandelde controles. De tweede stap van de procedure is het genereren en zuiveren van cDNA uit deze RNA-monsters.Het cDNA wordt vervolgens gebruikt om biotinyl-gelabeld cRNA te bereiden via in vitro transcriptie. De laatste stap van de procedure is de fragmentatie van de biotinyl-gelabelde cRNA's voor hybridisatie op de AFI metrics gist-genechips. Uiteindelijk kunnen resultaten worden behaald die de expressieverschillen in de twee gistmonsters tonen en via bio-informatica aan undergraduate studenten de kracht van microarray-analyse demonstreren.Het outreach-team van het Vermont Genetics Network bedacht deze methode toen zij de opdracht kregen om microarray-technologie aan wetenschapsstudenten in de hele staat Vermont aan te bieden om hun wetenschappelijke onderwijs te verbeteren. Tot nu toe is deze methode op meerdere locaties aan acht bachelorcolleges in de hele staat geïmplementeerd. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van microarray-onderwijsmodules is dat het ons in staat stelt om een groep individuen algemene moleculaire biologische technieken bij te brengen die dagelijks in het laboratorium worden gebruikt.Daarnaast kunnen we dit gebruiken om zowel studenten als docenten en onze onderzoeksgroepen te onderwijzen. In de praktijk werken studenten en professoren samen aan hetzelfde project. Ze leren bepaalde technieken die veel finesse vereisen, zoals het omgaan met RNA, wat geen eenvoudige taak is.Ze leren hoe ze DNA kunnen neerslaan met behulp van visualiseringsreagentia. Ze krijgen daadwerkelijk de kans om technieken toe te passen die ze zullen tegenkomen in hun master- of promotieonderzoek of in alledaagse moleculaire biologielaboratoria. Hoewel deze methode geschikt is voor het verkrijgen van inzicht in oxidatieve stress bij gist, is deze zeker toepasbaar op andere modelorganismen en andere biologische systemen die u wilt onderzoeken.Genexpressie verandert door ontwikkelingsprocessen, omgevingstoxines, specifieke ziektebeelden en vele andere factoren. Om de expressieverschillen te onderzoeken in gist die aan oxidatieve stress wordt blootgesteld, wordt eerst totaal RNA uit twee gistculturen geëxtraheerd via enzymatische lyse. Eén cultuur werd blootgesteld aan oxidatieve stress door een behandeling van één uur met 0,5 millimol waterstofperoxide in Hank's gebufferde zoutoplossing, terwijl de andere cultuur alleen met HBSS werd behandeld als controle.Begin met het labelen van twee microcentrifugebuisjes van 1,7 milliliter met de juiste identificatiegegevens. Breng 1,5 milliliter van de betreffende gistcultuur over in elk buisje. Centrifugeer de buisjes 2 minuten lang bij 5.000 Gs op kamertemperatuur.Verwijder na centrifugatie voorzichtig de supernatant met een micropipet en gooi deze weg zonder het pellet te verstoren. Controleer of het pellet groot genoeg is voordat u verdergaat met de procedure. Als het pellet te klein is, voeg dan 1,5 milliliters kweek toe aan dezelfde buis waarin het pellet zich bevindt en centrifugeer vervolgens om een groter pellet te verkrijgen.Verwijder het supernatant met een micropipet en verwijder zoveel mogelijk vloeistof van de gistpellet. Voeg vervolgens 100 µL SG-buffer en 30 µL liase-oplossing toe aan de gistpellet en meng dit door te vortexen. Incubeer beide buisjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.Wervel elke buis voorzichtig elke 10 minuten om sferoplasten te genereren. Een van de meest kritische stappen bij het uitvoeren van sferoplast-plating van gist is om er zeker van te zijn dat er na de behandeling daadwerkelijk honderd procent sferoplasten zijn gevormd. Dit betekent dat niet alle lytische enzymen gelijkwaardig zijn.U moet controleren of een goed lytisch enzym een goede sfero-plating oplevert, wat betekent dat u deze monsters op een microscoopglas moet aanbrengen en onder de microscoop moet controleren door 0,1% SDS toe te voegen om er zeker van te zijn dat er protoplasten zijn gevormd. Om een volledige sfero-plating waar te nemen, pipetteert u 10 µL van het gistmonster op een microscoopglas en onderzoekt u het monster onder de microscoop met 1 µL 0,1% SDS om de gistcellen te laten zwellen en perfecte sferen of sferoïden te vormen. Het is belangrijk om waar te nemen dat ook deделende cellen sferoïden vormen.Als er gedeeltelijke sfero-plaatvorming wordt waargenomen, wordt een verlengde behandeling met liase aanbevolen. Zodra volledige sfero-plaatvorming is bevestigd bij 350 microliters BRLT-buffer per buis, worden er 250 microliters 100%ethanol toegevoegd. Zorg dat de buis stevig is afgesloten door het deksel dicht te houden en vortex krachtig gedurende één minuut.Deze procedure wordt gebruikt om de Sphero-platen te lyseren. Gebruik daarna R en easy Z spin-kolommen om het RNA uit de twee culturen te verzamelen en te zuiveren. Evalueer tot slot de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA met behulp van een 1,2% precast agarosegel voor elektroforese om biotinyl-gelabeld cRNA voor te bereiden.Het totale RNA dat uit de gistcellen is geëxtraheerd, wordt eerst gebruikt voor de synthese van cDNA via reverse transcriptie. Bereid na de generatie van cDNA de phase lock gel-buisjes voor gebruik bij de cDNA-precipitatie; centrifugeer de phase lock gel-buisjes op maximale snelheid gedurende één minuut om er zeker van te zijn dat de gel zich onderaan de buis bevindt. Vortex de phase lock-buisjes niet. Pipetteer voor de precipitatie van cDNA 162 µL van de onderste laag van een PCI-mengsel (pH 8,0 tris-gebufferde fenol-chloroform-isoamylalcohol) en voeg dit toe aan de 162 µL inhoud van de reactiebuis voor de synthese van de tweede cDNA-streng; voor deze stap zijn gelijke volumes van de waterige en organische mengsels vereist.Vortex vijf seconden om de inhoud te mengen. Gebruik vervolgens een micropipet om het gehele CD N-A-P-C-I mengsel over te brengen naar de phase lock gel buis. Vortex de phase lock gel buis niet; centrifugeer op maximale snelheid gedurende twee minuten.Gebruik vervolgens een micropipet om de bovenste laag van de phase lock gel-buis over te brengen naar een nieuw gelabelde buis van 1,7 milliliter. Probeer zoveel mogelijk van deze laag te verzamelen. Voeg het volgende toe aan de microcentrifugebuis van 1,7 milliliter: 405 microliters 100% ethanol, 80 microliters ammoniumacetaat en één microliter pellet paint, en vortex.Plaats de buis kort in de centrifuge met het scharnier van de buis naar buiten gericht en centrifugeer 20 minuten op maximale snelheid. Neem de buis bij kamertemperatuur, zodra het centrifugeren is voltooid, voorzichtig uit de centrifuge, waarbij u erop let dat het CD NA-pellet niet wordt verstoord. Het pellet moet roze zijn vanwege de pelletverf en ongeveer de grootte van een zoutkorrel hebben.Plaats de CD NA pellet op ijs aan de zijkant van de buis onder het scharnier en ga onmiddellijk over tot het reinigen van de pellet. Om de procedure voor het reinigen van de CD NA pellet te starten, gebruikt u een P 1000 micropipet om voorzichtig al het supernatant uit de buis te verwijderen. Let erop dat u de pellet niet verstoort.Voeg 500 µL koude, 80% ethanol toe aan de buis met uw monster. Sluit de buis voorzichtig af en keer deze langzaam enkele keren om. Houd het pellet nauwlettend in de gaten om er zeker van te zijn dat het niet loslaat van de wand van de buis.Als het pellet loslaat, kunt u het terug naar de bodem van de buis brengen door de buis terug in het rek te plaatsen en het pellet naar de bodem te laten zakken, of door de buis 15 seconden op maximale snelheid te centrifugeren. Gebruik vervolgens een P 1000 micropipet om voorzichtig de ethanol te verwijderen zonder het pellet te verstoren. Kantel de buis om zoveel mogelijk vloeistof te kunnen verwijderen.Voeg een nieuw aliquot van koude, 80% ethanol toe, sluit de buis af en keer deze enkele keren langzaam om. Verwijder vervolgens zoveel mogelijk ethanol met een P 1000 micropipet. Centrifugeer de buis vijf seconden op maximale snelheid.Gebruik vervolgens een P 10 micropipet om de laatste microliters ethanol te verwijderen zonder het pellet te verstoren. Plaats de open buis gedurende 10 tot 20 minuten in een droogkast om de resterende ethanol te laten verdampen. Zodra het pellet droog is, kan het gemakkelijk verloren gaan; hanteer de buis daarom voorzichtig en sluit de dop.Wanneer het drogen is voltooid, visualiseer dan het gedroogde pellet om te bevestigen dat dit in de buis aanwezig is. Resuspendeer het gedroogde pellet tot slot in 22 µL RNA-vrij water en plaats de buis op ijs. Dit cDNA wordt vervolgens gebruikt om biotine-gelabeld cRNA te prepareren via in vitro transcriptie met gebruik van de Enzo BioArray-kit.Nadat het biotine-gelabelde cRNA is gereinigd en gekwantificeerd, wordt het gefragmenteerd voor de targetpreparatie. Zodra het cDNA is gegenereerd, gebruiken we standaard in vitro transcriptiemethodologie om gebiotinyleerd cRNA te produceren. Het cRNA moet worden gefragmenteerd voordat het op de microarraychip kan worden aangebracht.Om deze procedure te starten, brengt u een hoeveelheid CRNA gelijk aan 5 µg over naar een gelabelde PCR-buis van 0,5 ml. Voeg voldoende RNase-vrij water toe om het totale volume op 16 µL te brengen, en voeg vervolgens 4 µL van een 5x fragmentatiebuffer toe aan de buis. Het totale volume in de buis moet 20 µL zijn.Vortex de buis en centrifugeer gedurende 10 seconden. Incubeer de buis vervolgens 30 minuten bij 94 °C. Plaats de buis na de incubatie in een thermocycler op ijs.Het gefragmenteerde en ongefragmenteerde CRNA van elk monster wordt vervolgens geanalyseerd via elektroforese met behulp van een 1,2% precast AROS-gel. Wanneer de run is voltooid, wordt de gel gevisualiseerd op een transilluminator en wordt er een afbeelding gemaakt. Het uiteindelijke syntheseproduct wordt gehybridiseerd met de atric gistgen-chips en representatieve resultaten van de microarray-analyse worden hier getoond.Deze eerste figuur is een voorbeeld van een gescande afbeelding van een atrics gist-genechip, gegenereerd door de bedieningssoftware van de atrics-genechip. Dit is een 2D-spreidingsdiagram van alle genetische transcripten, ongeveer 6.700 genen, waarbij controlegegevens en behandelde gistgegevens worden vergeleken. Elk punt vertegenwoordigt één enkel gen.Genen die paars gekleurd zijn, geven aan welke genen differentieel tot expressie komen, terwijl rood gekleurde genen dat niet doen. In dit voorbeeld zijn de meeste differentieel tot expressie gebrachte genen betrokken bij de controle van de celcyclus, zoals blijkt uit hun beschrijvingen. Dit stroomschema uit de database voor annotatievisualisatie en geïntegreerde ontdekking illustreert differentieel tot expressie gebrachte genen in een aangetast biologisch pad.De genen die zijn aangegeven met een rode ster zijn de downregulated genen in het mitotische pad. Tot slot worden hier representatieve resultaten van een volcano plot getoond die is gegenereerd met de geo species gene sifter-software. Controle- en behandelde monsters werden vergeleken met een P-waarde drempelwaarde van 0,05 en een drempelwaarde voor expressieverandering van 1,5 fold.We hebben gekozen voor het gebruik van gist omdat gist snel en eenvoudig te kweken is, maar we realiseerden ons ook dat het meest kritieke onderdeel van het werken met gist eigenlijk het creëren van een goede spheroplastenplating is. Een van de dingen die we bij microarray willen vermijden, is een onvolledige digestie, waardoor alleen spheroplastencellen worden geplate die zich in een G1- of een G2M-fase bevinden. Je zou dan een microarray-experiment uitvoeren op gistcellen die zich in een specifieke replicatiefase bevinden.Een ander complex punt dat we in deze oefening willen duidelijk maken, is dat het pelleten van CD NA iets is waar mensen dagelijks over praten, maar dat het niet noodzakelijkerwijs eenvoudig is. In onze module hebben we daarom gespecialiseerde buisjes en visualiseringsreagentia gebruikt. Hierdoor kunnen we DNA daadwerkelijk centrifugeren en kun je de pellet visualiseren, wat het zowel voor studenten als docenten eenvoudiger maakt.Zodat dit na de ontwikkeling in alle fasen van DNA- en RNA-werk kan worden gebruikt. Deze module heeft echt de weg vrijgemaakt voor docenten aan de Baccalaureate-instituten om verder te onderzoeken, mogelijk door te kijken naar andere modelorganismen of andere behandelingsregimes die compatibel zijn met bestaande curricula of mogelijk hun eigen onderzoeksinteresses. Om u een voorbeeld te geven van enkele van de wijzigingen die zijn aangebracht: er was één locatie die keek naar de effecten van herbicidenbehandeling op gist, een andere die keek naar LAMP IDE-behandeling in gist, terwijl een andere locatie keek naar de ontwikkelingsveranderingen in een mammale cellijn waarin zij specifiek geïnteresseerd waren.En tot slot heeft een andere locatie gekeken naar de impact van differentiële lichtbronnen op arabidopsis of planten. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het opzetten van een microray-experiment met bachelorstudenten in de wetenschap, inclusief de isolatie van totaal RNA uit gist, de generatie van cDNA en de fragmentatie van biotine-gelabeld cRNA. Praktijkervaring met dergelijke hoogwaardige technologieën helpt om het wetenschappelijk onderwijs op bachelorniveau te versterken en te consolideren.

microarray-analysis-for-saccharomyces-cerevisiae

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

GFP-fusie-eiwitten worden op grote schaal gebruikt om de organellen visualiseren door confocale microscopie. Echter, screening voor mutaties die de morfologie van organellen invloed vereist in het algemeen individueel mutagenese en is tijdrovend. Hier tonen we een methode om simultaan te nemen organel-GFP markers in bijna 5.000 niet-essentiële genen in gist.

Een high-throughput methode om wereldwijd de studie van de morfologie organel in S. cerevisiae

Microarray analyse werd uitgevoerd om genetische expressie profielen...

Het bepalen van genetische expressie profielen in C. elegans Met behulp van microarray en real-time PCR

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Dit protocol beschrijft een experimentele procedure voor het uitvoeren...

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

We beschrijven chromatin endogene splitsing gekoppeld aan high-throughput sequencing (ChEC-seq), een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) -orthogonale methode voor het mappen van eiwitbindingsplaatsen genoom-wijd met micrococculaire nuclease (MNase) fusie-eiwitten.

Genoom-wide mapping van eiwit-DNA-interacties met ChEC-seq in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Hier presenteren we een protocol met behulp van RNA-seq mRNA niveaus volgen na verloop van tijd tijdens de hypoxische reactie van S. cerevisiae cellen. Deze methode kan worden aangepast aan het analyseren van genexpressie tijdens elke cellulaire reactie.

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Het protocol hier beschreven is gebaseerd op het genoom-brede kwantificeren van nieuw samengestelde mRNA gezuiverd van gistcellen aangeduid met 4-thiouracil. Deze methode maakt het mogelijk om het meten van de mRNA-synthese rekken van mRNA verval en biedt dus een nauwkeurige meting van RNA polymerase II transcriptie.

Saccharomyces cerevisiae Metabole labelen met 4-thiouracil en de kwantificering van gesynthetiseerd mRNA nieuw als een Proxy voor RNA Polymerase II activiteit

Wederzijdse hemizygosity via sequencing (RH-SEQ) is een krachtige nieuwe methode om de genetische basis van een eigenschap verschil tussen soorten in kaart te worden. Pools van hemizygotes worden gegenereerd door transposon mutagenese en hun fitheid wordt bijgehouden door concurrerende groei met behulp van High-through sequencing. Analyse van de resulterende gegevens wijst genen aan die aan de eigenschap ten grondslag liggen.

Genetische mapping van Thermotolerance verschillen tussen soorten Saccharomyces gist via genoom-brede wederzijdse Hemizygosity analyse

Een knelpunt in de 'design-build-test' cyclus van microbiële engineering is de snelheid waarmee we functionele schermen van stammen kunnen uitvoeren. We beschrijven een high-throughput methode voor stam screening toegepast op honderden tot duizenden gistcellen per experiment dat droplet-gebaseerde RNA sequencing gebruikt.

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

Dit protocol presenteert een locus-specifieke chromatine-isolatiemethode op basis van plaatsspecifieke recombinatie om een single-copy genlocus van belang in zijn natuurlijke chromatinecontext te zuiveren van ontluikende gist, Saccharomyces cerevisiae.

Single-Copy Gene Locus Chromatine Zuivering in Saccharomyces cerevisiae

RNA secundaire structuur is voornamelijk waargenomen in rijp RNA met structuurprobingmethoden. Co-transcriptionele structuurvolgsequencing (CoSTseq) verenigt nucleaire run-on, die is gebruikt om de positie van polymerase op beginnend RNA te bestuderen, met structuuronderzoek. CoSTseq maakt hiermee observatie mogelijk van de secundaire structuur van RNA in RNA onder actieve transcriptie.

Vergelijkende RNA-structuuranalyse van ontluikende en rijpe transcripten in Saccharomyces cerevisiae

Leer microarray-analyse met RNA-isolatie, cDNA-synthese en biotin-markering voor Saccharomyces cerevisiae. Deze methode toont genexpressieveranderingen bij oxidatieve stress aan studenten.

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae

Meer video's verkennen