Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae
7 april 2011
In dit protocol, genexpressie in gist ( Saccharomyces cerevisiae) Wordt gewijzigd na blootstelling aan oxidatieve stress veroorzaakt door de toevoeging van waterstofperoxide (H 2 O 2), Een oxidatiemiddel.
Het algemene doel van deze procedure is om studenten bachelor wetenschappen te introduceren in microarray-technologie door de expressieverschilleningen te onderzoeken in gist die oxidatieve stress ondergaat. Dit wordt bereikt door eerst het totale RNA te isoleren uit gistculturen behandeld met waterstofperoxide en de onbehandelde controles. De tweede stap van de procedure is om CDNA te genereren en te zuiveren uit deze RNA-monsters.
Het CDNA wordt vervolgens gebruikt om biotin-gelabelde CRNA te bereiden via in vitro transcriptie. De laatste stap van de procedure is de fragmentatie van de biotin-gelabelde CRNA's voor hybridisatie op de AFI metrics gist gen chips. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de expressieverschilleningen in de twee gistmonsters laten zien en door middel van bioinformatica de kracht van microarray-analyse aan bachelor studenten demonstreren.
Het Vermont Genetics Network Outreach team kwam voor het eerst met het idee voor deze methode toen ze werden belast met het leveren van microray-technologie aan wetenschapsstudenten in de staat Vermont om hun wetenschappelijk onderwijs te verbeteren. Tot op heden is deze methode geleverd op meerdere locaties bij acht bachelorcolleges in de hele staat. Dus het belangrijkste voordeel van het gebruik van microray in lesmodules, het geeft ons de mogelijkheid om algemene moleculaire biologietechnieken te onderwijzen die dagelijks in het laboratorium worden gebruikt aan een groep personen.
En we kunnen dit ook gebruiken om studenten en leraren te leren in onze groepen. We hebben eigenlijk studenten en professoren die samenwerken aan hetzelfde project. Ze leren bepaalde technieken die veel vaardigheid vereisen, zoals het omgaan met RNA, wat geen gemakkelijke taak is.
Ze leren hoe ze DNA kunnen precipiteren met behulp van visualisatiereagentia. Ze krijgen de kans om de technieken te gebruiken die ze in hun afstudeerstudie of in dagelijkse moleculaire biologielaboratoria zullen tegenkomen. Hoewel deze methode geschikt is om inzicht te krijgen in oxidatieve stress en gist, is het zeker toepasbaar op andere modelorganismen en andere biologische systemen die je misschien wilt bekijken.
Genexpressieveranderingen, of ze nu geassocieerd zijn met ontwikkelingsveranderingen, omgevingstoxines, specifieke ziektetoestanden en echt nog veel meer. Om de expressieverschilleningen in gist die oxidatieve stress ondergaat te onderzoeken, wordt eerst totaal RNA geëxtraheerd uit twee gistculturen door enzymatische lysis. De ene cultuur werd blootgesteld aan oxidatieve stress door een uur behandeling met 0,5 millimolair waterstofperoxide in Hank's gebufferd zoutoplossing terwijl de andere cultuur alleen met HBSS als controle werd behandeld.
Begin door twee 1,7 milliliter microcentrifugebuisjes te labelen met de juiste identificatie-informatie. Breng 1,5 milliliter van de juiste gistcultuur in elke buis. Centrifugeer de buisjes 2 minuten bij 5.000 Gs op kamertemperatuur.
Na centrifugatie gebruik je een micropipet om voorzichtig het supernatant te verwijderen en weg te gooien zonder het pellet te verstoren. Controleer of het pellet groot genoeg is voordat je verder gaat met de procedure. Als het pellet te klein is, voeg je 1,5 milliliter cultuur toe aan dezelfde buis met het pellet en centrifugeer vervolgens om een groter pellet te verkrijgen.
Gooi het supernatant weg met een micropipet en verwijder zoveel mogelijk vloeistof van het gistpellet. Voeg vervolgens 100 microliter SG-buffer en 30 microliter liaas-oplossing toe aan het gistpellet en vortex om te mengen. Incubeer beide buisjes 30 minuten op kamertemperatuur tijdens de incubatie.
Zwiep voorzichtig met elke buis elke 10 minuten om plakken te genereren. Een van de meest cruciale stappen bij het sphero-platen van gist is om ervoor te zorgen dat je daadwerkelijk honderd procent Sphero-plast hebt gecreëerd na de behandeling. Dat betekent niet dat alle lytische enzymen gelijk zijn.
Dus je moet controleren of goed lytisch enzym je goed sphero-platen geeft, wat betekent dat je deze monsters moet nemen, op een microscoopglaasje moet leggen en onder de microscoop moet controleren door 0,1%SDS toe te voegen om ervoor te zorgen dat je protoplastvorming hebt. Om volledige sphero-platering waar te nemen, pipet je 10 microliter van het gistmonster op een microscoopglaasje terwijl je het monster onder de microscoop observeert bij een microliter van 0,1%SDS om de gistcellen te laten zwellen en perfecte sferen of sferoïd te vormen. Het is belangrijk om waar te nemen dat de kiemende cellen ook S-sferoïd vormen.
Als gedeeltelijke sphero-platering wordt waargenomen, wordt een verlengde behandeling met liaas aanbevolen. Zodra volledige sphero-platering is bevestigd, voeg je 350 microliter BRLT-buffer toe aan elke buis en vervolgens 250 microliter 100% ethanol. Zorg ervoor dat de buis goed wordt afgesloten door de dop gesloten te houden en krachtig voor een minuut te vortexen.
Deze procedure zal de Sphero-platen lyseren. Gebruik vervolgens R en easy Z spin kolommen om het RNA uit de twee culturen te verzamelen en te reinigen. Evalueer ten slotte de kwaliteit van het geëxtraheerde RNA met behulp van 1,2% voorgevormd aros-gel voor elektroforese om biotin-gelabeld CRNA te bereiden.
Het totale RNA dat uit de gistcellen is geëxtraheerd, wordt eerst gebruikt om CD NA te synthetiseren door middel van reverse transcriptie. Na CD NA-generatie bereid faseslotgelbuisjes voor voor gebruik bij CD NA-precipitatie, centrifugeer faseslotgelbuisjes op volle snelheid gedurende één minuut om ervoor te zorgen dat de gel zich op de bodem van de buis bevindt. Vortex de faseslotbuisjes niet om CD NA te bezinken, pipet 162 microliter van de onderste laag van een pH 8,0 tris-gebufferde fenylchloroform, isoamyalcohol of PCI-mengsel en voeg toe aan de 162 microliter inhoud van de tweede streng, CD NA-synthesereactiebuis gelijke volumes van waterige en organische mengsels zijn vereist voor deze stap.
Vortex gedurende vijf seconden om de inhoud te mengen. Gebruik vervolgens een micropipet om alle CD N-A-P-C-I-mengsel naar het faseslotgelbuisje over te brengen. Vortex niet in het faseslotgelbuisje, centrifugeer op
Overzicht
Dit protocol laat zien hoe genexpressie in gist (Saccharomyces cerevisiae) verandert na oxidatieve stress veroorzaakt door waterstofperoxide (H2O2). Het is bedoeld om bachelorstudenten te onderwijzen over microarray-technologie door praktische toepassing.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Genexpressieanalyse
- Microarray-technologie
- Oxidatieve stress in gist
Achtergrond
- Het begrijpen van veranderingen in genexpressie is cruciaal voor het bestuderen van cellulaire reacties op stress.
- Microarray-technologie maakt de analyse van meerdere genen tegelijkertijd mogelijk.
- Deze methode verbetert de wetenschapseducatie voor bachelorstudenten.
- Oxidatieve stress is een veelvoorkomende omgevingsfactor die cellulaire functies beïnvloedt.
Doel van het onderzoek
- Om studenten kennis te laten maken met microarray-technologie.
- Om verschillen in genexpressie in gist onder oxidatieve stress te onderzoeken.
- Om praktische ervaring te bieden met moleculaire biologietechnieken.
Gebruikte methoden
- Isolatie van totaal RNA uit gistculturen behandeld met waterstofperoxide en controles.
- Generatie en zuivering van cDNA uit RNA-monsters.
- Bereiding van biotin-gelabeld cRNA voor hybridisatie.
- Gebruik van bioinformatica om genexpressiegegevens te analyseren.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle extractie en analyse van RNA uit gistculturen.
- Demonstratie van genexpressieveranderingen als gevolg van oxidatieve stress.
- Betrokkenheid van studenten bij praktische moleculaire biologietechnieken.
- Toepassing van bevindingen op andere biologische systemen en onderzoek.
Conclusies
- Het protocol leert effectief essentiële moleculaire biologietechnieken.
- Studenten krijgen waardevolle inzichten in genexpressieanalyse.
- Deze methode kan worden aangepast voor verschillende biologische studies buiten gist.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Microarray analysis of Saccharomyces cerevisiae under oxidative stress provides a scalable platform for interrogating gene expression changes in response to environmental perturbations. This workflow enables high-throughput, quantitative assessment of transcriptional responses, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in discovery pipelines. The approach is adaptable to diverse model systems, facilitating portfolio-wide translational continuity.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of gene expression changes following defined oxidative stress.
- Supports functional target validation by quantifying transcriptional responses to controlled perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking by mapping pathway-level gene regulation events.
- Provides data for predictive confidence in early-stage biological hypotheses.
Screening & Assay Development
- Delivers validated RNA extraction and labeling workflows for reproducible gene expression profiling.
- Standardizes sample preparation and hybridization for downstream microarray analysis.
- Generates quantitative, scalable readouts suitable for comparative screening studies.
- Enables robust assay development for evaluating compound or environmental effects on gene expression.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression outputs with disease-relevant or stress-response pathways in model organisms.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling pathway mapping.
- Provides a framework for adapting workflows to additional biological systems or treatment regimens.
- Facilitates risk-adjusted advancement decisions based on quantitative molecular data.
Pipeline & Workflow Integration
This microarray protocol integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven perturbation studies through lead identification and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying gene expression changes after oxidative challenge.
- Screening: Provides reproducible, quantitative microarray outputs for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Enables statistical analysis of differential gene expression using fold-change and p-value thresholds.
- Translational Research: Offers adaptability to other model organisms and stressors for broader translational insights.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for gene expression profiling across multiple research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes RNA handling, labeling, and hybridization for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by providing robust molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA extraction, labeling, and microarray hybridization techniques.
- Needs access to microarray instrumentation and bioinformatics analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to various model systems and treatment regimens with protocol modifications.
- Dependent on RNA quality and completeness of cell lysis for reliable downstream analysis.
