Name: Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Leer time-lapse live-imaging van neurale progenitorcellen in het ontwikkelende zebravis voorhersenen. Deze methode combineert elektroporatie met confocale microscopie voor klonale analyse in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door theNIH grantNS042626. We danken Kurt Thorn en UCSF Nikon Imaging centrum voor hulp bij beeldvorming.

1. Voorbereiding van de zebravis embryo's <ol><li> Twee dagen voor elektroporatie, opgericht paring kooien van de wilde soort vis met behulp van tussenschotten te scheiden mannetjes van de vrouwtjes. </li><li> Een dag voor elektroporatie, trek de verdelers in paring kooien van de vorige dag. </li><li> Verzamel embryo's en incubeer 50 bevruchte embryo's in 30 ml embryonale medium dat 0,003% phenylthiourea (PTU) bij 28,5 ° C. </li><li> Op de dag van elektroporatie, dechorionate de embryo's handmatig met fijne pincet (Inox 5, Dumont Electronic, Zwitserland) wanneer de embryo's het ontwikkelingsstadium van de 22hpf te bereiken. Vervolgens transfer van de embryo's te 10ml elektroporatie beltoon's 3 (180 mM NaCl, 5mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 5 mM Hepes pH 7,2) met 0,003% PTU. </li><li> Voeg 420 ul tricaïne voorraad (4mg/ml) om de 10ml elektroporatie beltoon aan verdoven van de embryo's. </li></ol> 2. Voorbereiding voor Elektroporatie <ol><li> Glas injectienaalden werden getrokken uit capillairen (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, met gloeidraad) op een Flaming-Brown P897 trekker (Sutter Instruments, Novato, CA, USA). De naald was afgebroken met een tang om een ​​scherpe punt te krijgen zoals weergegeven in figuur 1D. De diameter van de tip moet ongeveer 10 urn en de taper hoek moet ongeveer 30 graden. </li><li> Bereid 0,8% en 1% een lage smeltpunt agarose (Shelton Scientific, Inc catalogus # IB70050) in een oplossing elektroporatie Ringer's. Aliquot de agarose opgelost in 2 ml microcentrifugebuizen. Bewaar de monsters in een warmte-blok ~ 37 ° C. </li><li> Het Gal4/UAS systeem wordt gebruikt om genexpressie rijden in neurale stamcellen van embryo's geëlektroporeerd. Twee plasmiden worden gebruikt: plasmide EF1α-GFF-PT2KXIG, waarin Gal4FF wordt aangedreven door de alomtegenwoordige promotor EF1α, en plasmide UAS-E1B-EGFP-PT2KXIG. </li><li> Bereid EF1α-GFF-PT2KXIG en UAS-E1B-EGFP-plasmide DNA met behulp van PT2KXIG GenEluteTM HP Plasmid Midiprep Kit (Sigma). </li><li> De plasmiden worden dan geconcentreerd door natriumacetaat / ethanol precipitatie aan de uiteindelijke concentratie van 1-2 ng / pl in 10 mM Tris · Cl (pH 8,5). </li><li> Meng de twee plasmiden en verdun met nuclease-vrij H2O tot een uiteindelijke concentratie van 500 ng / ul voor elk plasmide. Toevoeging van fenol rood (1 / 10 verdund totaal volume) aan de oplossing heeft de voorkeur voor de visualisatie van de levering. Houd de DNA-oplossing op het ijs. </li><li> Vlak voor elektroporatie, frictie de injectienaald met 2 ui DNA-oplossing en pas de injectie volume op 2 nl. </li></ol> 3. Elektroporatie <ol><li> Een stero dissectie microscoop (Zeiss Stemi 2000 met een maximale vergroting van 50x), een luchtdruk injector (Narishige IM 300 microinjector), twee micromanipulators (WPI M3301R, World precisie-instrumenten, Sarasota, FL, USA), en een elektrische stimulator (SD9 square pulse stimulator, Gras Tlefactor, West Warwick, Rhode Island, USA) zijn opgezet als in figuur 1A. </li><li> Om de embryo's, dompel twee embryo's monteren in 1% lage smeltpunt agarose. Dan onmiddellijk verwijderen van de embryo's uit de agarose met een glazen pipet. </li><li> Plaats de embryo's op een omgekeerde plastic petrischaal deksel in individuele druppels van agarose. Voorzichtig oriënteren van de embryo's met een vezel sonde naar een rug-up positie voordat de agarose stolt, zodat de voorhersenen is toegankelijk voor zowel de elektroden en de micro-injectie naald (Figuur 1B). Embryo's moeten worden gemonteerd in afzonderlijke agarose druppels. </li><li> Manipuleer de elektroden met de linker micromanipulator. Plaats de elektroden in de agarose zoals weergegeven in figuur 1B. Aangepaste platina iridium parallel bipolaire elektroden 125 micrometer in diameter en zitten 500 micrometer van elkaar worden gebruikt voor elektroporatie (FHC, catalogus # PBSA0575). </li><li> Steek de micro-injectie naald in de voorhersenen ventrikel en injecteer 4NL DNA mix, zoals stroming van rode vloeistof en de zwelling van de hartkamer kan worden waargenomen. </li><li> Onmiddellijk werd een 28,5 V puls 1 milliseconde handmatig aangebracht. Draai dan de polariteit en toe te passen een meer 28,5 V puls 1 milliseconde. Dit zal resulteren in bilaterale mozaïek etikettering van de voorhersenen neurale progenitor cellen. </li><li> Na elektroporatie van 10 embryo's, voeg 5 ml embryonale medium om de embryo's te dekken en schil de agarose met een microchirurgische mes om de embryo's vrij te geven. </li><li> Breng de geëlektroporeerd embryo's om een ​​nieuwe schotel van 30 ml embryonale medium dat 0,003% PTU en incubeer bij 28,5 ° C. </li></ol> 4. Montage en Time-lapse Live-Imaging <ol><li> Rond 4 uur na elektroporatie, is het EGFP signaal waarneembaar wanneer bekeken onder een microscoop epifluorescerende ontleden. </li><li> Vijf uur na de elektroporatie, selecteert u de embryo's met zeer mozaïek, maar sterk EGFP expressie in de voorhersenen regio. </li><li> Overdracht van de geselecteerde embryo's 10ml embryonale medium met 0,003% PTU. </li><li> Voeg 420 ul tricaïne voorraad (4mg/ml) om de 10ml embryonale medium to verdoven van de embryo's. </li><li> Om de embryo's monteren, dompel een embryo in 0,8% een laag smeltpunt agarose. Dan onmiddellijk verwijderen van de embryo uit de agarose met een glazen pipet en plaats het embryo in het midden van een 35mm glazen bodem cultuur schotel (MatTek corporatie, Part # P35GC-1.5-10-C, <a href="http://www.glass-bottom-dishes.com/">www.glass-bottom-dishes.com</a> ) . </li><li> Voorzichtig oriënteren van de embryo's met een vezel sonde naar een rug-up positie vóór de agarose stolt. </li><li> De juiste plaats de schotel op de temperatuur gecontroleerde fase van de confocale microscoop zoals weergegeven in figuur 1C (We maken gebruik van een Nikon C1 spectrale confocale microscoop met up-rechts doelstellingen). Breng de temperatuur op 28,5 ° C. </li><li> Voeg 3 ml 28,5 ° C voorverwarmde embryonale medium met 0,003% PTU om de embryo te dekken. Het embryo is nu klaar voor de beeldvorming. </li><li> Uitvoeren van time-lapse leven beeldvorming met een vast interval met behulp van een water dompelen doelstelling. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Weergegeven in figuur 2 zijn geselecteerd frames van een time-lapse confocale live-beeldvorming van het embryo geëlektroporeerd van EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP op 22 hpf. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Apparatuur set-up. (A) De montage van elektroporatie apparatuur: de Grass-SD9 vierkante pulse stimulator (i), de linker micromanipulator (ii), de elektroden (iii), de Zeiss dissectiemicroscoop (iv), de injectienaald (v), het recht micromanipulator (vi) en de Narishige IM 300 microinjector (vii). (B) De relatieve positie van de elektroden (i), de voorhersenen ventrikel (ii) en de injectienaald (iii). Let op de rood-gekleurde DNA-oplossing werd ingespoten in de voorhersenen ventrikel. (C) De Algemene Vergadering van de live imaging op de Nikon C1 confocale microscoop: de temperatuur controller (i), het water dompelen doel len (ii) en de geëlektroporeerd embryo ingebed in een laag smeltpunt agarose in een glazen bodem cultuur schaal (iii) (D ) Afbeelding van een getrokken en snijd naald voor micro-injectie van DNA. <img src="/files/ftp_upload/2594/2594fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Geselecteerde frames van een 18-uurs time-lapse confocale live-beeldvorming van het embryo geëlektroporeerd met EF1α-GFF + UAS-E1B-EGFP op 22 hpf. Hartkamer oppervlak is aan de onderkant van elke afbeelding frame. Schaalbalk staat voor 10 micrometer.

<ol><li>Temple, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The development of neural stem cells.</a> Nature. 414, 112-117 (2001).</li>
<li>G#246;tz, M., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of neurogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 6, 777-788 (2005).</li>
<li>Cerda, G. A., Thomas, J. E., Allende, M. L., Karlstrom, R. O., Palma, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+DNA%2C+RNA%2C+and+morpholinos+into+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Electroporation of DNA, RNA, and morpholinos into zebrafish embryos.</a> Methods. 39, 207-211 (2006).</li>
<li>Hendricks, M., Jesuthasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+methods+for+in+vivo%2C+whole+mount+and+primary+culture+analysis+of+zebrafish+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based methods for in vivo, whole mount and primary culture analysis of zebrafish brain development.</a> Neural. Dev. 2, 6-6 (2007).</li>
<li>Tawk, M., Bianco, I. H., Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+electroporation+in+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Focal electroporation in zebrafish embryos and larvae.</a> Methods Mol. Biol. 546, 145-151 (2009).</li>
<li>Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+adult+fish%3A+a+new+tool+to+study+fin+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration.</a> Genesis. 32, 27-31 (2002).</li>
</ol>

In deze video tonen we een methode voor time-lapse live-beeldvorming van neurale stamcellen op een klonale niveau in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen. We testten en gewijzigd de elektroporatie bestaande protocollen 4-6 om genetisch en fluorescent label individuele neurale progenitor cellen. Een afstamming boom bestaat uit klonaal verwante nakomelingen cellen kunnen worden vastgesteld, omdat slechts een paar cellen werden dun gemerkt met een relatief lage spanning van elektroporatie. In aanvulling ...

time-lapse live-imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precieze patronen van verdeeldheid, migratie en differentiatie van neurale progenitorcellen zijn cruciaal voor een goede ontwikkeling van de hersenen en de functie 1,2. Om te begrijpen van het gedrag van neurale progenitor cellen in het complex in vivo omgeving, is het time-lapse live-imaging van neurale stamcellen in een intacte hersenen kritisch nodig. In deze video maken we gebruik van de unieke kenmerken van de zebravis embryo&#39;s naar de ontwikkeling van de voorhersenen neurale progenitor cellen in vivo te visualiseren. We maken gebruik van elektroporatie van genetisch en dun label individuele neurale progenitor cellen. Kortom, DNA-constructen die coderen voor fluorescerende merkers werden geïnjecteerd in de voorhersenen ventrikel van 22 uur na de bevruchting (HPF) zebravis embryo&#39;s en elektrische pulsen werden onmiddellijk afgeleverd. Zes uur later werden de zebravis embryo&#39;s geëlektroporeerd gemonteerd met een laag smeltpunt agarose in glazen bodem cultuur gerechten. Fluorescent gelabelde neurale progenitor cellen werden vervolgens belicht voor 36 uur met vaste intervallen onder een confocale microscoop met behulp van water te dompelen objectief. De huidige methode biedt een manier om inzicht te krijgen in de in vivo ontwikkeling van voorhersenen neurale progenitor cellen en kan worden toegepast op andere delen van het centrale zenuwstelsel van de zebravis embryo.

De huidige video toont een methode die gebruik maakt van de combinatie van elektroporatie en confocale microscopie te leven imaging op individuele neurale stamcellen uit te voeren in de zich ontwikkelende zebravis voorhersenen.<em&gt; In vivo</em&gt; Analyse van de ontwikkeling van de voorhersenen neurale stamcellen op een klonale niveau kan worden bereikt op deze manier.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Precieze patronen van deling, migratie en differentiatie van neurale progenitorcellen zijn cruciaal voor een correcte ontwikkeling en functie van de hersenen1,2. Om ...

Het doel van het volgende experiment is om de in vivo ontwikkeling van individuele neurale progenitorcellen in de voorhersenen te observeren via time-lapse live-imaging van zebravissenembryo's. Dit wordt bereikt door electroporatie van DNA-constructen die coderen voor fluorescerende markers die schaars gepositioneerde neurale progenitorcellen in de voorhersenen labelen. Geëlectroporeerde embryo's worden geanestheseerd, gemonteerd in laagsmeltende agarose en afgebeeld met time-lapse confocale microscopie.De resultaten tonen de in vivo ontwikkeling van een specifieke neurale progenitorcel van de voorhersenen. Deze methode kan inzicht bieden in de in vivo ontwikkeling van neurale progenitorcellen in de voorhersenen. Het kan ook worden toegepast op andere regio's van het centrale zenuwstelsel, zoals het hersenvlies, de hersenstam en het ruggenmerg.Het belangrijkste voordeel van deze methode ten opzichte van bestaande methoden, zoals DNA- of RNA-injectie in het enkelcellige stadium, is dat deze zeer gericht is op het eigenbelang op elk gegeven ontwikkelingsmoment. Dit protocol begint de dag vóór de geplande electroporatie. Verzamel 's ochtends 50 bevruchte embryo's van gepaarde zebravis

time-lapse-live-imaging-clonally-related-neural-progenitor-cells

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

De sleutel tot het begrijpen van de morfogenetische processen die de vroege embryo vorm is de mogelijkheid om beeld-cellen met een hoge resolutie. We beschrijven hier een techniek voor het etiketteren van enkele cellen of kleine clusters van cellen in zijn geheel zebravis embryo's met membraan-gerichte Green Fluorescent Protein.

Etikettering en Imaging Cellen in de zebravis achterhersenen

In deze video worden de technieken voor multicolor confocale time-lapse imaging en gerichte cel ablatie verstrekt. Time-lapse imaging wordt gebruikt om het gedrag van meerdere celtypen van belang te...

Multicolor Time-lapse imaging van transgene zebravis: Visualizing netvlies Stem Cells geactiveerd door middel van gerichte neuronale cellen Ablation

Source: Williams, A. L., et al. Multi-Photon Time Lapse Imaging to Visualize Development in Real-time: Visualization of Migrating Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2017)This video showcases a multi-photon time-lapse imaging protocol to visualize the migration of neural crest cells in a zebrafish embryo in real-time with high resolution.

Visualizing Neural Crest Cell Migration in a Zebrafish Embryo Using Multi-Photon Time Lapse Imaging

Time-lapse confocale beeldvorming is een techniek nuttig voor het karakteriseren van embryonale ontwikkeling. Hier beschrijven we de methode karakteriseren craniofaciale morfogenese in wildtype en PDGFRA, Smad5 en SMO mutant embryo's.

Het analyseren Craniofacial Morphogenesis in zebravis behulp 4D confocale microscopie

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

In vivo imaging is een krachtig hulpmiddel dat kan worden gebruikt om de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het zenuwstelsel te onderzoeken. Hier beschrijven we een techniek voor het gebruik van time-lapse confocale microscopie om grote aantallen multicolor Brainbow-gelabelde cellen in real time te visualiseren binnen het zich ontwikkelende zebraviszenuwstelsel.

Visualiseren van de zich ontwikkelende hersenen in levende zebravissen met behulp van Brainbow en Time-lapse Confocalimaging

Hier presenteren we een methode om de zebravis embryonale hersenen in vivo tot larvale en juveniele stadia in beeld te brengen. Deze microinvasieve procedure, aangepast aan elektrofysiologische benaderingen, biedt toegang tot cellulaire en subcellulaire details van volwassen neuronen en kan worden gecombineerd met optogenetica en neurofarmacologische studies voor het karakteriseren van hersenfunctie en medicamenteuze interventie.

In vivo beeldvorming van volledig actief hersenweefsel in wakkere zebravislarven en juvenielen door schedel- en huidverwijdering

Hier presenteren we een protocol om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen.

Calciumbeeldvorming met twee fotonen van de activiteit van de voorhersenen bij zich gedragende volwassen zebravissen

We demonstreren een methode die gebruik maakt van snelle confocale scanscopie om live beeldvorming uit te voeren van microgliacellen in het zich ontwikkelende optische tectum van zebravissen, waardoor de dynamiek van deze cellen in vivo kan worden geanalyseerd.

Live beeldvorming en karakterisering van de dynamiek van microglia in het zebravisembryo

Leer time-lapse live-imaging van neurale progenitorcellen in het ontwikkelende zebravis voorhersenen. Deze methode combineert elektroporatie met confocale microscopie voor klonale analyse in vivo.

Time-lapse Live-Imaging van klonaal verwante neurale progenitorcellen in de ontwikkelingslanden zebravis voorhersenen

Meer video's verkennen