Name: Hele Cell Opnemen van een organotypische Slice Voorbereiding van de neocortex (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Leer hele-celopnames maken van piramidale neuronen in organotypische neocorticale sneden van ratten. Deze methode behoudt fysiologische kenmerken en maakt elektrofysiologisch onderzoek naar genetische manipulaties mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Mayumi Sakuraba en Rebecca Foehring bedanken voor de uitstekende technische ondersteuning. Daarnaast zouden we graag Drs bedanken. Rodrigo Andrade voor hulp bij de uitvoering van de organotypische slice cultuur en biolistische transfectie protocollen en dr. Jeanne Nerbonne voor het aanbieden van ons met cDNA constructen voor transfectie. Dit werk werd ondersteund door NIH subsidie: NS044163 van NINDS (tot RCF).

<ol><li>Beique, J. C., Imad, M., Mladenovic, L., Gingrich, J. A., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+the+5-hydroxytryptamine+2A+receptor-mediated+facilitation+of+synaptic+activity+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Mechanism of the 5-hydroxytryptamine 2A receptor-mediated facilitation of synaptic activity in prefrontal cortex.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 9870-9875 (2007).</li>
<li>Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+neural+responses+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Timing of neural responses in cortical organotypic slices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 4897-4902 (2003).</li>
<li>Caeser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+development+of+slice+cultures+from+rat+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex.</a> Exp Brain Res. 77, 234-244 (1989).</li>
<li>Foehring, R. C., Toleman, T., Higgs, M., Guan, D., Spain, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actions+of+Kv2.1+channels+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Soc+Neurosci+Abstr%22%5BJournal%5D)">Actions of Kv2.1 channels in rat neocortical pyramidal neurons.</a> Soc Neurosci Abstr. 34, (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 4, 329-342 (1981).</li>
<li>Gähwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+cultures+of+neural+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic cultures of neural tissue.</a> Trends Neurosci. 11, 484-489 (1988).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Thompson, S. M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Maintenance+of+Organotypic+Slice+Cultures+of+CNS+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preparation and Maintenance of Organotypic Slice Cultures of CNS Tissue.</a> Current Protocols in Neuroscience. , 6.11.1-6.11.11 (2001).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+biophysical+properties+of+Kv1+channels+in+supragranular+neocortical+pyramidal+neurones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Expression and biophysical properties of Kv1 channels in supragranular neocortical pyramidal neurones.</a> J Physiol. 571, 371-389 (2006).</li>
<li>Guan, D., Lee, J. C. F., Higgs, M., Spain, W. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+Kv1+containing+channels+in+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Functional roles of Kv1 containing channels in neocortical pyramidal neurons.</a> J. Neurophysiol. 97, 1931-1940 (2007).</li>
<li>Guan, D., Tkatch, T., Surmeier, D. J., Armstrong, W. E., Foehring, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kv2+subunits+underlie+slowly+inactivating+potassium+current+in+rat+neocortical+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kv2 subunits underlie slowly inactivating potassium current in rat neocortical pyramidal neurons.</a> J Physiol. 581, 941-960 (2007).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+chronic+stimulation+of+cortical+organotypic+cultures+using+implanted+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for chronic stimulation of cortical organotypic cultures using implanted electrodes.</a> Neurosci Methods. 176, 136-143 (2009).</li>
<li>Johnson, H. A., Buonomano, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+plasticity+of+spontaneous+activity+and+Up+states+in+cortical+organotypic+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Development and plasticity of spontaneous activity and Up states in cortical organotypic slices.</a> J Neurosci. 27, 5915-5925 (2007).</li>
<li>Malin, S. A., Nerbonne, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+rectifier+K%2B+currents%2C+IK%2C+are+encoded+by+Kv2+alpha-subunits+and+regulate+tonic+firing+in+mammalian+sympathetic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Delayed rectifier K+ currents, IK, are encoded by Kv2 alpha-subunits and regulate tonic firing in mammalian sympathetic neurons.</a> J Neurosci. 22, 10094-10105 (2002).</li>
<li>O'Brien, J. A., Holt, M., Whiteside, G., Lummis, S. C., Hastings, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modifications+to+the+hand-held+Gene+Gun%3A+improvements+for+in+vitro+biolistic+transfection+of+organotypic+neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Modifications to the hand-held Gene Gun: improvements for in vitro biolistic transfection of organotypic neuronal tissue.</a> J Neurosci Methods. 112, 57-64 (2001).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Villalobos, C., Shakkottai, V. G., Chandy, K. G., Michelhaugh, S. K., Andrade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKCa+channels+mediate+the+medium+but+not+the+slow+calcium-activated+afterhyperpolarization+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SKCa channels mediate the medium but not the slow calcium-activated afterhyperpolarization in cortical neurons.</a> J Neurosci. 24, 3537-3542 (2004).</li>
<li>Walker, P. D., Andrade, R., Quinn, J. P., Bannon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+analysis+of+preprotachykinin+promoter+activity+in+single+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Real-time analysis of preprotachykinin promoter activity in single cortical neurons.</a> J Neurochem. 75, 882-885 (2000).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>O'Brien, J. A., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neuronal+cultures+using+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Proc%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neuronal cultures using a hand-held gene gun.</a> Nat Proc. 1, 977-981 (2006).</li>
<li>Joshi, P., Dunaevsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun+transfection+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene gun transfection of hippocampal neurons.</a> J Vis Exp. , (2006).</li>
<li>Biewanga, J. E., Destree, O. H., Scharma, L. H. J Neurosci Met. 71, 67-75 (1997).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben het bestuderen van de expressie en functionele rol van voltage-gated kalium kanalen in piramidale neuronen van de rat neocortex (4, 9-11). Vanwege het gebrek aan specifieke farmacologische middelen voor deze kanalen, gebruiken we een genetische benadering voor het manipuleren van kanaal expressie (1,14,15,17-19). Wij gebruiken een organotypische cultuur voorbereiding (2,3, 5-8, 12,13,15-22). Gewijzigd ten opzichte van de aanpak van Stoppini et al. (16), om de cel morfologie en de laminaire pa...

Chirurgie / transfectie / cultuur: <ol><li> Brain Slicer: Campden Vibroslice # MA572 Wereld precisie-instrumenten, Sarasota, FL, USA </li><li> Gene Gun System: Bio-Rad Helios # 165-2431 (Bio-Rad Laboratories, 1000 Alfred Nobel Drive, Hercules, CA 94547) <ul><li> Inclusief: Gene pistool, helium slang met regulator, slangen prep station (# 165 tot 2.418), spuit kit, Tefzel buizen, buizen snijder, optimalisatie kit (# 165 tot 2424), slangen snijder </li><li> Bio-Rad Helium Regulator (# 165-2413) </li><li> disposable materialen voor Helios van Bio-Rad: <ul><li> 1,6 um Goud microdragers: # 165-2264 </li><li> Tefzel Tubing: # 165-2441 </li></ul></li></ul></li><li> Incubator: Forma wetenschappelijk model # 3110 (Thermo-Scientific: (866) 984 tot 3766). </li></ol> Media: <ol><li> Paard Serum: Hyclone donor paarden # 30074 SH. (Hyclone, 925 West 1800 Zuid, Logan, UT 84321) </li><li> HMEM (Minimal Essential Media plus HBSS en HEPES, geen glutamine: Lonza BioWhittaker Catalog # 12-137f): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 tot 6288, optie 1. </li><li> HBSS (GIBCO Hanks gebufferde zoutoplossing, # 24020-117): GIBCO / Invitrogen, (800) 955 tot 6288, optie 1. </li><li> MEM (GIBCO minimaal essentieel medium, # 12360-038), GIBCO / Invitrogen, (800) 955 tot 6288, optie 1. </li><li> 250 ml Millipore 0,2 um filter: # SC6PU02RE </li><li> Plastic Transfer pipetten: Fisher # 13-711-20. </li><li> 50 ml Millipore steriflip 0,22 um filter (# SCGP00525) </li></ol> Items 6-8 verkregen uit: Fisher Scientific, 1241 ambassadeur Blvd, Postbus 14989, St. Louis, MO 63132. Opname: <ol><li> Pipet glas: Harvard GC150TF-10: Harvard Apparatuur, 84 oktober Hill Road, Holliston, Massachusetts 01746 </li><li> Sutter P-87 horizontaal elektrode puller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949 </li><li> Axon Instrumenten Multiclamp 700B versterker: Molecular Devices, Inc 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94.089 tot 1,136 </li><li> PClamp 10 data-acquisitie software: Molecular Devices, Inc, 1311 Orleans Drive, Sunnyvale, CA 94089 tot +1,136 </li><li> lectrode positie wordt geregeld met Sutter ROE-200 manipulatoren en PC-200 controller: Sutter Instrument Company, One Digital Drive, Novato, CA 94949. </li><li> Microscoop: Olympus BX-50WI rechtop microscoop met IR-DIC optiek </li><li> IR-gevoelige camera OLY-150 (Olympus) of dage-MTI (dage-MTI, 01 Noord-Roeske Avenue, Michigan City, IN 46360). </li></ol>

hele cell opnemen van een organotypische slice voorbereiding van de neocortex

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We hebben het bestuderen van de expressie en functionele rol van voltage-gated kalium kanalen in piramidale neuronen van de rat neocortex. Vanwege het gebrek aan specifieke farmacologische middelen voor deze kanalen, hebben we een genetische benadering voor het manipuleren van kanaal expressie. We maken gebruik van een organotypische cultuur voorbereiding (16) om cel morfologie en de laminaire patroon van de cortex te behouden. We meestal isoleren acute neocorticale plakken op postnatale dagen 8-10 en onderhouden van de plakjes in de cultuur voor 3-7 dagen. Dit laat ons toe om neuronen studeren op dezelfde leeftijd met die in ons werk met acute plakjes en minimaliseert de ontwikkeling van uitbundige prikkelende verbindingen in de slice. We opnemen van visueel-geïdentificeerde piramidale neuronen in lagen II / III of V met behulp van infrarood verlichting (IR-) en differentieel interferentie contrast microscopie (DIC) met whole cell patch clamp in de huidige-of spanning-klem. Wij gebruiken biolistische (Gene gun) transfectie van wild type of mutant kaliumkanaal DNA om expressie van de kanalen om hun functie studie te manipuleren. De getransfecteerde cellen zijn gemakkelijk te herkennen aan epifluorescentie microscopie na co-transfectie met cDNA voor groen fluorescerend eiwit (GFP). We vergelijken opnames van getransfecteerde cellen naar aangrenzende, ongetransfecteerde neuronen in dezelfde laag van dezelfde slice.

Dit is een protocol voor te bereiden en een neocorticale slice voorbereiding handhaven organotypische cultuur voor het maken van elektrische opnames van piramidale neuronen.

Hele Cell Opnemen van een organotypische Slice Voorbereiding van de neocortex

We hebben de expressie en functionele rollen van spanningsgestuurde kaliumkanalen in piramidale neuronen uit de neocortex van ratten bestudeerd. Vanwege de ...

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van elektrische opnames van parametale neuronen in organotypische coupes van de neocortex. Dit wordt bereikt door eerst acute coupes te snijden van ratten in de postnatale leeftijd P8 tot P10. De tweede stap van de procedure is het effectueren van Bic-transfectie van CD NA. De derde stap van de procedure is het kweken van de coupes gedurende drie tot zeven dagen.De laatste stap van de procedure is het verkrijgen van elektrische registraties van getransfecteerde cellen met behulp van current- of voltage-clamp. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat parametale cellen in organotypische coupes vergelijkbare eigenschappen hebben als die in acute coupes van dezelfde leeftijd. Transfectie met GFP verandert deze eigenschappen niet, waardoor de studie van neuronen na genetische manipulaties van ionkanalen mogelijk is via whole-cell current- of voltage-clamp registraties.Het belangrijkste voordeel van deze techniek, in tegenstelling tot bijvoorbeeld acute coupes, is dat cellen lang genoeg in een normale omgeving kunnen worden gehouden om ionkanalen genetisch te kunnen manipuleren. De methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de ionkanalen, zoals de functionele rollen van specifieke typen ionkanalen. Bereid de laminaire flowkast, de vacuümflowkast, de chirurgische benodigdheden en de oplossingen voor zoals gespecificeerd in het bijbehorende manuscript. Draag handschoenen bij alle volgende stappen nadat de bereide 250 milliliters snijoplossing is gefilterd; verdeel hiervan 40 milliliters in een bekerglas van 50 milliliter.Plaats de snijkamer, het aliquot van 40 milliliter en de resterende 210 milliliters van de snijoplossing in de vriezer bij minus 20 graden Celsius onder de laminaire flowkast. Breng 1.1 milliliters kweekmedium aan in drie diagonaal gelegen putjes van een zes-putjesplaat. Herhaal dit voor een tweede.Zeswellsplaat. Plaats de zeswellsplaten gedurende ten minste één uur in een incubator bij 37 °C. Gebruik vervolgens een steriele schaar om vier transferpipetten in te korten, die gebruikt zullen worden voor het overbrengen van de coupes.Nog eens drie pipetten blijven intact wanneer de oplossingen slibachtige mengsels zijn geworden. Haal het aliquot van 40 milliliter snijoplossing uit de vriezer en plaats het onder de vacuümkap. Belucht het met 95% oxygen, 5% carbon dioxide.Haal vervolgens de 210 milliliters snijoplossing uit de vriezer en plaats deze onder de laminaire flow-kap voor beluchting. Belucht deze met 95% oxygen en 5% carbon dioxide. Haal daarna het wasmedium uit de koelkast en belucht dit met 100% oxygen onder de laminaire flow-kap.Breng twee milliliters kweekmedium aan in een Petrischaal. Plaats het overgebleven kweekmedium in de koelkast om het medium gedurende de week te kunnen vervangen ter voorbereiding op het snijden van de hersenen. Giet ongeveer 10 milliliters koude snijoplossing vanuit het bekerglas van 50 milliliter in een bekerglas van 25 milliliter onder de vacuümkap.Verwijder na anesthesie en decapitatie de hersenen van een rat van acht tot 10 postnatale dagen. Was de hersenen gedurende ongeveer 30 seconden in het bekerglas met 30 milliliters koude snijoplossing. Breng de hersenen vervolgens voorzichtig over naar het bekerglas van 25 milliliter.Vervang de handschoenen en verzadig deze met ethanol. Breng het brein vervolgens in de koude snijoplossing over naar de laminaire flowkast. De volgende stap is het oriënteren en blokkeren van het brein door het cerebellum en de frontale pool te verwijderen en een gedeeltelijke midsagittale snede te maken; plak het geblokkeerde brein op de objecttafel met de frontale cortex naar boven.Maak indien nodig extra sneden met het scalpel om de grootte van de plakjes te beperken. Plaats vervolgens de houder met de hersenen in de gesteriliseerde metalen snijkamer. Bevestig deze aan de vibrerende weefselsnijder.Vul het bad met ijskoud, gebelderd snijmedium. Giet 30 milliliters van het resterende snijmedium in een bekerglas van 50 milliliter en belder dit met 95% oxygen, 5% carbon dioxide. Dit bekerglas wordt gebruikt om de coupes op te vangen.Snijd coronale coupes van 250 micron van de frontopariëtale cortex. Plaats ten minste zes coupes in de beker van 50 milliliter met de snijoplossing. Plaats vervolgens ongeveer twee milliliter wasmedium in een Petrischaal van 35 millimeter.Breng de plakjes met een afgesneden pipet over van de snijoplossing naar de Petrischaal met wasmedium. Was de plakjes drie keer door met verse pipetten medium toe te voegen en de afvaloplossingen na het wassen af te zuigen; breng de plakjes vervolgens over naar de 35 millimeter Petrischaal met kweekmedium. Verwijder daarna de bovenkappen van de verpakkingen van de mesh-inzetten, maar laat de inzetten in de verpakkingen.Gebruik vervolgens een pincet om één mesh-inzet met behulp van een afgesneden transferpipet uit de verpakking te tillen. Breng één plakje van het kweekmedium over naar de mesh. Plaats en positioneer het plakje in het midden van het membraan met behulp van een intacte transferpipet.Verwijder alle overtollige kweekmedia. Plaats vervolgens het gaasinzetstuk met de plak in een van de met vloeistof gevulde wells van de zes-wellsplaat. Let erop dat er geen luchtbellen onder het gaas ontstaan nadat er in elke met vloeistof gevulde well één plak is geplaatst.Plaats beide zes-wells platen terug in de incubator en incubeer deze gedurende ongeveer één uur bij 37 °C. Reinig ondertussen het werkgebied onder de laminaire flowkast ter voorbereiding op de transfectie. De volgende stap is het laden van het BioRad Helios gene gun, waarbij de eerste positie vrij blijft.Plaats een cartridge met CD NA-gecoate bullets in om en om in de posities van de cartridgehouder van het genenpistool. Plaats vervolgens de cartridgehouder in het genenpistool. Maak het pistool eerst vrij door een loop zonder bullets af te vuren.Schuif vervolgens de loop naar een patroon met CDNA.Bullets. Haal de zeswells-platen uit de incubator en plaats ze onder de laminaire flow-kast. Houd het pistool verticaal net boven de bovenkant van de zeswells-plaat, schiet een slice af bij 100 PSI, schuif dan de loop verder en maak deze opnieuw leeg door een blank af te vuren. Schiet de resterende slices af met één schot per slice.Plaats de platen met zes putjes na het filmen terug in de incubator en incubeer de coupes gedurende twee tot zeven dagen bij 37 °C met 5% koolstofdioxide tijdens de incubatieperiode. Vervang het medium om de dag als volgt: voeg onder de laminaire flowkap nieuw medium toe aan de drie onbezet putjes. Plaats de plaat met zes putjes vervolgens gedurende ten minste één uur terug in de incubator; keer na een uur terug naar de laminaire kap en gebruik met ethanol gereinigde gebogen pincetten om elk mesh-inzetstuk met de bijbehorende coupe naar een nieuw putje te verplaatsen, aspireer het oude medium en plaats de plaat terug in de incubator.Na enkele dagen incubatie zijn de coupes nu klaar voor whole-cell registraties. Haal een zes-wells plaat uit de incubator onder de laminaire flowkast. Gebruik met ethanol gereinigde gebogen pincetten om één mesh-insert met de bijbehorende coupe te verwijderen.Plaats vervolgens de zes-wells plaat terug in de incubator. Verplaats daarna de Petrischaal met de mesh-inzet en de slice naar het opnamegebied, waarbij spanning wordt aangebracht met een pincet of een flexibel stuk metaal. Gebruik indien nodig een scalpel nummer 11 om het gaas rondom de slice weg te snijden en maak de laatste inkepingen af met de schaar.Gebruik vervolgens een pincet om de slice en het bevestigde gaas over te brengen naar de registratiekamer. Baad de slice op de tafel van een rechtopstaande microscoop in carbogeen-gebaseerde kunstmatige cerebrospinale vloeistof onder IR DIC-optiek. Visualiseer de parametale neuronen in laag twee, drie of vijf onder epi-fluorescentie en het fitz-filter.Lokaliseer de groene getransfecteerde cellen onder IR DIC-microscopie. Zoek naar de CDNA-bullets, die zichtbaar zijn als kleine zwarte stipjes in de cellen. Selecteer een getransfecteerde cel voor whole-cell recording.Breng vervolgens een micro-elektrode naar de geselecteerde cel en gebruik voorzichtig zuiging om een giga-ohm seal te verkrijgen. Pas daarna extra zuiging toe om de cel binnen te dringen voor whole-cell registratie. De cel is nu klaar voor zowel current- als voltage-clamp registraties.Deze figuur toont een fluorescentiebeeld van cellen die zijn getransfecteerd met cDNA voor GFP. De volgende opnames zijn afkomstig van cellen die zijn getransfecteerd met cDNA voor GFP. Hier wordt een actiepotentiaal getoond in een parametale cel in laag drie als reactie op een supra-drempelwaarde stroominjectie van 10 milliseconden.Deze figuur toont repetitieve vuring van een parametaal neuron in laag vijf als reactie op een stroominjectie van 400 pico amp gedurende twee seconden. Deze figuur toont een voltage-clamp registratie van een parametaal neuron in laag vijf. Tetrodotoxine werd gebruikt om de spanningsafhankelijke natriumstroom te blokkeren.De traces representeren uitwaartse kaliumstromen opgewekt door een reeks spanningsstappen van 500 milliseconde vanuit een holdingpotentiaal van minus 70 millivolt. Eenmaal beheerst, kunnen de lichte preparatie en transfectie in ongeveer twee uur worden voltooid, inclusief de voorbereidingstijd. Bij het uitvoeren van deze procedure.Het is belangrijk om steriele omstandigheden te handhaven en de dikte en afmetingen van het coupesnippertje te beperken om uitdroging te voorkomen. Bedankt voor het kijken. Veel succes met uw experiment.Dank u wel.

whole-cell-recording-from-an-organotypic-slice-preparation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit protocol beschrijft een organotypische slice assay geoptimaliseerd voor de postnatale hersenen en hoge-resolutie time-lapse beeldvorming van neuroblast migratie in de rostrale migratie stroom.

Een organotypische Slice Assay voor High-Resolution Time-Lapse Imaging van neuronale migratie in de postnatale Brain

This video demonstrates positioning a fine-pointed pipette near brain slices, forming a seal with a neuronal cell. Suction breaks the cell membrane, thereby creating a whole-cell patch clamp that enables current measurements for electrophysiology experiments.

Establishing a Whole-Cell Voltage-Clamp Configuration for Electrophysiological Recordings in Brain Slices

This video outlines a method for simultaneously imaging and recording electrical activity from transgenic brain slices that contain neuron-specific fluorescent proteins. The procedure involves maintaining the brain slice in a perfusion chamber with aerated artificial cerebrospinal fluid, using a light source to excite fluorescent-labeled cells, and recording the electrical signals with a multichannel probe and patch clamp.

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

Paaropnamen zijn gelijktijdige gehele cel patch clamp opnamen van twee synaptisch verbonden neuronen, waardoor een nauwkeurige elektrofysiologische en farmacologische karakterisering van de synapsen tussen individuele neuronen mogelijk wordt. Hier beschrijven we de gedetailleerde methodologie en vereisten voor het vestigen van deze techniek in organotypische hippocampale plakculturen in elk laboratorium dat is uitgerust voor elektrofysiologie.

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Gesloten-lus protocollen worden steeds gebruikelijker in de moderne elektrofysiologie. We presenteren een eenvoudige, veelzijdige en goedkope manier om complexe elektrofysiologische protocollen uit te voeren in corticale piramidale neuronen in vitro, met behulp van een desktopcomputer en een digitale acquisitiekaart.

Real-time Electrofysiologie: Met behulp van Closed-loop protocollen bij Probe Neuronale Dynamics and Beyond

Hier wordt een procedure gepresenteerd om selectief een neuronaal eiwit te activeren met een korte lichtpuls door genetisch een foto-reactieve onnatuurlijke aminozuur te coderen in een doelneuronaal eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen in cultuur of in vivo.

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Dit protocol laat zien op de uitvoering van een geoptimaliseerde N-methyl-D-glucamine (NMDG) beschermende herstelmethode van hersenen segment voorbereiding. Een formulering van één medium wordt gebruikt om op betrouwbare wijze het verkrijgen van gezonde hersenen segmenten van dieren van alle leeftijden en voor diverse experimentele toepassingen.

Voorbereiding van Acute hersenen segmenten met behulp van een geoptimaliseerde N-Methyl-D-glucamine beschermende herstelmethode

In dit artikel bespreken we drie hersenen preparaten die worden gebruikt voor het opnemen van de klem van het flard van hele cel om te studeren het retinotectal circuit van Xenopus laevis kikkervisjes. Elk preparaat, met zijn eigen specifieke voordelen, draagt bij aan de experimentele werkwillig van de Xenopus tadpole als een model om te studeren van neurale functie.

Preparaten en protocollen voor de hele cel Patch klem opname van Xenopus laevis Tectal neuronen

Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

Hier presenteren we protocollen voor de bereiding van acute hersen schijfjes met de laterale geniculate Nucleus en het elektrofysiologisch onderzoek van retinogeniculate en corticogeniculate synapsen functie. Dit protocol biedt een efficiënte manier om te bestuderen van de synapsen met de hoge-release en lage-release kans in dezelfde acute hersenen segmenten.

Elektrofysiologische onderzoeken van Retinogeniculate en Corticogeniculate Synapse functie

Hier presenteren we een protocol dat virale transductie van discrete hersengebieden beschrijft met optogenetische constructies om synapsspecifieke elektrofysiologische karakterisering in acute hersenplakken van knaagdieren mogelijk te maken.

Ex Vivo | Optogenetische ondervraging van synaptische transmissie en plasticiteit op lange afstand van mediale prefrontale cortex naar laterale entorhinale cortex

Leer hele-celopnames maken van piramidale neuronen in organotypische neocorticale sneden van ratten. Deze methode behoudt fysiologische kenmerken en maakt elektrofysiologisch onderzoek naar genetische manipulaties mogelijk.

Hele Cell Opnemen van een organotypische Slice Voorbereiding van de neocortex

Meer video's verkennen