Name: Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-15T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Leer hoe je meiotische cellen uit muizentestes zuivert met flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde cel sortering. Deze methode maakt hoogzuivere isolatie mogelijk voor cytogenetisch en expressieonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit project werd mede ondersteund door geld van de staat Florida aan Scripps en toekenning nummers R01GM085079 en R21HD061304 van het Nationale Instituut van Algemene Medische Wetenschappen en het National Institute of Child Health and Human Development, respectievelijk. Dit is het aantal handschrift 20917 van het Scripps Research Institute.

Dit protocol kan worden gescheiden in twee grote stappen: (1) de dissociatie en Hoechst 33342 kleuring van de muis testis cellen gevolgd door, indien nodig, (2) FACS-sortering van de relevante meiotische fracties, met inbegrip van alle stadia van de meiose, uit kiemcellen tot ronde spermatiden. Eenmaal verzameld, kunnen deze hoogverrijkt meiotische bevolkingsgroepen worden gebruikt voor een breed scala aan analyse. Dit protocol beschrijft de dissociatie van een volwassen testis; volumes kunnen worden aangepast voor jongeren of voor extra testes. 1. Testis Dissociatie <ol><li> Plaats een decapsulated testis in een 15 ml buis. </li><li> Voeg 3 ml van Balans Gey's Salt Solution (GBSS) met 120 U / ml Collagenase type I. </li><li> Voeg 10 ul van DNAse I (1mg/ml stockoplossing in 50% glycerol) en schud het met de hand tot je testikels tubuli beginnen te distantiëren. </li><li> Agiteren horizontaal op maximaal 120 rpm gedurende 15 minuten bij 33 ° C. </li><li> Decanteren gedurende 1 min verticaal bij kamertemperatuur en gooi supernatant. </li><li> Herhaal de stappen 1,2 tot 1,5. </li><li> Voeg 2,5 ml van GBSS met Collagenase type I, 50 ul van een 50mg/ml Trypsine voorraadoplossing opnieuw gesuspendeerd in 1 mM HCl-oplossing, en 10 ul van DNAse I (1mg/ml), en draai de buis een paar keer. </li><li> Agiteren horizontaal op maximaal 120 rpm gedurende 15 minuten bij 33 ° C. </li><li> Met behulp van plastic wegwerp Pasteur pipet met brede opening, pipet voorzichtig op en neer voor 3 min.No klonten moeten zichtbaar zijn op dit punt. </li><li> Voeg 30 pi van trypsine, 10 ul van DNAse I, 40 pi van Hoechst 33342 geresuspendeerd in DMSO (10 mg / ml), en draai de buis een paar keer. </li><li> Agiteren horizontaal op maximaal 120 rpm gedurende 15 minuten bij 33 ° C. </li><li> Voeg 400-ul van foetaal kalf serum (FCS) en meng door naar trypsine te inactiveren. </li><li> Laatste kleuring is uitgevoerd door het toevoegen van 50 pi van Hoechst 33342 geresuspendeerd in DMSO (10 mg / ml), en 10 ul van DNAse I (1 mg / ml). </li><li> Agiteren horizontaal op maximaal 120 rpm gedurende 15 minuten bij 33 ° C. </li><li> De gedissocieerde testis monster wordt vervolgens door twee 40-um GBSS pre-bevochtigd wegwerpfilters over een 50-ml conische buis, dan 5 ul van propidiumjodide (PI) oplossing wordt toegevoegd en monster wordt voorzichtig gemengd door pipetteren verschillende keren met wegwerp Pasteur pipet. </li><li> Monster wordt overgebracht naar een 5-ml plastic spuit door middel van een 18-gauge naald. De laatste wordt vervangen door een 22-gauge naald voor sample levering. De spuit is opgeslagen op ijs en beschermd tegen het licht tot aan de verwerking van FACS. </li></ol> 2. FACS Setup en zuivering <ol><li> Sorteren werd uitgevoerd op een Becton-Dickinson Aria IIU cell sorter. De beschreven omstandigheden moet daarom worden gebruikt als een startpunt in het bijzonder bij het gebruik van verschillende apparatuur. We gebruikten voorwaarden eerder beschreven 7,8. </li><li> Omdat de Aria IIU niet beschikt over een UV-laser, we paste het protocol voor het detecteren van Hoescht kleuring met behulp van een 405nm violet laser daarnaast hebben we een 488nm blauwe laser wordt gebruikt voor voor-en zijwaartse verstrooiing detectie. Daarnaast werden een aantal filters gewijzigd om een ​​aantal rode laser lekkages resulteert in een betere verspreide plot scherpte te beperken. </li><li> De violette laser werd geconfigureerd met een 450/40nm band pass voor de detectie van Hoescht Blue emissie en een 585/42nm band pass voor Hoescht Red emissie. Een 502nm lange pass werd gebruikt voor het scheiden van rood blauwe fluorescentie. </li><li> Een 100 um mondstuk werd gebruikt met een druppel aandrijving frequentie van 28.000 druppels / seconde. Het monster drempel bedroeg ongeveer 4000 events / seconde. De temperatuur control optie werd gebruikt voor het monster en verzamelen van tubes te handhaven op 4 ° C de gehele duur van het sorteren. Daarnaast werd het monster agitatie voorziening waarmee de gebruiker bij 200 omwentelingen per minuut om het monster te voorkomen dat sedimenting de hele soort. </li><li> Meestal twee tot drie testikels worden verwerkt per 6 uur sorteren zodat de collectie van 0.5-2.0x10 6 cellen voor elke populatie (zie representatief gedeelte). </li><li> Het monster werd gesorteerd in porties van ongeveer 750μl vrijgesteld van de spuit. Ondertussen, tijdens deze pauzes de verzameling buizen werden bewaard bij 4 ° C, beschermd tegen het licht en voorzichtig voorafgaand aan de hervatting van sorteren gemengd. </li><li> De gesorteerde monsters werden verzameld in een 12x75mm glazen boorsilicaat collectie buis met 250μl DMEM aangevuld met 10% FCS. </li></ol> 3. Representatieve resultaten: Een typische FACS profiel wordt weergegeven in figuur 1. Alle belangrijke stappen van de meiose worden geïdentificeerd en worden aangegeven in de legenda. Als de Hoechst 33342 vlek is niet optimaal, zal de wereldwijde profiel lijken veel compacter en minder gedefinieerd. Een veel voorkomend probleem betreft niet het toevoegen van voldoende DNAse, die een snelle cel klonteren zal leiden. Toevoeging van extra DNAse bij alle aangeklaagd stappen lost meestal dit probleem. Freeze eawing van het DNAse voorraad (bewaard bij -20 ° C) moet tot een minimum beperkt, omdat dit resulteert in een snelle verlies van de enzymactiviteit. Spo11 is het meiotische endonuclease dat de dubbel-breuken op plaatsen van meiotische recombinatie hotspots 12 regisseert. Figuur 2 laat de typische profielen van een Spo11-null testis, waar dubbelstrengs breuken niet worden gevormd, wat resulteert in een mislukte meiose 12, evenals een pre-puberous profiel van een 13-dagen oude muis, die asynchrone karakter van deze eerste golf van de meiose onthult. Standaard cytogenetische analyses met behulp van de combinatie van synaptonemal complex eiwit 3 (SCP3) en gefosforyleerd histon H2AX antilichamen stadium-specifieke meiose markers dient in eerste instantie worden gebruikt voor het bevestigen van de zuiverheid en de aard van de gesorteerde cellen in de meiose, zoals beschreven elders 11. <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig1.jpg" alt="Figuur 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 1"> Figuur 1. Wild-type meiose FACS profielen. A) Representatieve spreidingsdiagram wordt weergegeven. De gated cellen worden getoond. Let op de grote hoeveelheid vuil aanwezig is bij volwassen testis die voornamelijk leeg membranen en spermatid staarten. B) Een vertegenwoordiger PI plot geeft de zeer beperkte hoeveelheid van de PI positieve cellen aanwezig in een monster. De typische poort wordt weergegeven. C) Een vertegenwoordiger wild-type Hoechst 33342 FACS profiel wordt weergegeven. De verschillende meiotische celpopulaties dat kan worden gezuiverd met behulp van deze methode voor verdere studie worden aangegeven: spermatogonia (Sp), pre-leptotene (PL), leptotene-zygotene (L / Z), vroeg-Pachytene (EP), midden-Pachytene ( mP), late-Pachytene (LP), diploteen (D), en ronde spermatiden (RS). <img src="/files/ftp_upload/2602/2602fig2.jpg" alt="Figuur 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figuur 2"> Figuur 2. Spo11-null-en wild-type dag 13 meiotische FACS profielen. A) Een typische Spo11-null profiel wordt weergegeven met een duidelijke meiotische mislukking, waar geen enkel moment voorbij de leptotene / zygotene vroeg-pachytene kan worden gedetecteerd. B) Het profiel van een 13-dagen-oude wild-type mannelijke muizen toont de hoge concentratie van leptotene / zygotene cellen. Deze eerste golf van meiose is vrij asynchroon, zoals duidelijk gevisualiseerd met behulp van deze methodiek.

<ol><li>Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+composition+of+fractions+of+mouse+testis+cells+following+velocity+sedimentation+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation.</a> Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).</li>
<li>Grabske, R. J., Lake, S., Gledhill, B. L., Meistrich, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugal+elutriation%3A+separation+of+spermatogenic+cells+on+the+basis+of+sedimentation+velocity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Centrifugal elutriation: separation of spermatogenic cells on the basis of sedimentation velocity.</a> J. Cell. Physiol. 86, 177-189 (1975).</li>
<li>Purification, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((culture%2C+and+fractionation+of+spermatogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">culture, and fractionation of spermatogenic cells.</a> Methods Enzymol. 225, 84-113 (1993).</li>
<li>Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcett, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+spermatogenic+cells+by+sedimentation+velocity.+A+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. A morphological characterization.</a> Dev. Biol. 49, 119-131 (1976).</li>
<li>Meistrich, M. L., Trostle, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+mouse+testis+cells+by+equilibrium+density+centrifugation+in+renografin+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Separation of mouse testis cells by equilibrium density centrifugation in renografin gradients.</a> Exp. Cell Res. 92, 231-244 (1975).</li>
<li>Namekawa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmeiotic+sex+chromatin+in+the+male+germline+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice.</a> Curr. Biol. 16, 660-667 (2006).</li>
<li>Lassalle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+Population%27+cells+in+adult+mouse+testis+express+Bcrp1+gene+and+are+enriched+in+spermatogonia+and+germinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Side Population' cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells.</a> Development. 131, 479-487 (2004).</li>
<li>Bastos, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+characterization+of+viable+meiotic+and+postmeiotic+cells+by+Hoechst+33342+in+mouse+spermatogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis.</a> Cytometry A. 65, 40-49 (2005).</li>
<li>Chowdhury, R., Bois, P. R., Feingold, E., Sherman, S. L., Cheung, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+variation+in+human+meiotic+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of variation in human meiotic recombination.</a> PLoS Genet. 5, e1000648-e1000648 (2009).</li>
<li>Roig, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+TRIP13%2FPCH2+is+required+for+recombination+and+normal+higher-order+chromosome+structure+during+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Mouse TRIP13/PCH2 is required for recombination and normal higher-order chromosome structure during meiosis.</a> PLoS Genet. 6, (2010).</li>
<li>Getun, I. V., Wu, Z. K., Khalil, A. M., Bois, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+occupancy+landscape+and+dynamics+at+mouse+recombination+hotspots%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome occupancy landscape and dynamics at mouse recombination hotspots.</a> EMBO Rep. 11, 555-560 (2010).</li>
<li>Romanienko, P. J., Camerini-Otero, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Spo11+gene+is+required+for+meiotic+chromosome+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">The mouse Spo11 gene is required for meiotic chromosome synapsis.</a> Mol. Cell. 6, 975-987 (2000).</li>
</ol>

Het protocol vermeld in dit document maakt het mogelijk om tegelijk te zuiveren van volwassen mannelijke muizen het hele bereik van de meiotische podium cellen met een zeer hoge zuiverheid, waardoor onderzoekers de dynamiek studie van deze fundamentele proces. Gezuiverde cellen kunnen worden gebruikt voor tal van toepassingen, variërend van RNA-extractie 9,10, nucleosoom in kaart brengen van 11, recombinant molecuul detectie, eiwit analyses, en nog veel meer. Echter, detectiemethoden moeten worden ...

<table><tbody><tr><td>Collagenase Type-1</td><td>Worthington Biochemical</td><td>CLSS1</td><td>Oplossen tot 12,000U/ml in GBSS, bewaren bij 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Worthington Biochemical</td><td>TRL3</td><td>Oplossen in 1mM HCl tot 50mg/ml, bewaren bij 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst 33342</td><td>Acros Organics</td><td>230001000</td><td>Verzadigde oplossing (10mg/ml in DMSO, bewaren bij 4&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DNEP</td><td>Oplossen in water/50% glycerol tot 1mg/ml, bewaren bij -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Gey&amp;rsquo;s Balance Salt Solution </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9779</td><td></td></tr><tr><td>6&quot; Transferpipet</td><td>Fisher Scientific</td><td>137119D</td><td></td></tr></tbody></table>

flowcytometrie zuivering van mouse cellen in de meiose

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Het heterogene karakter van de celtypen in de testis en de afwezigheid van meiotische celkweek modellen zijn belangrijke obstakels voor de studie van de unieke differentiatie programma&#39;s die zich manifesteren zijn tijdens de meiose. Twee belangrijkste methoden zijn ontwikkeld om, te zuiveren in verschillende mate, diverse meiotische fracties uit zowel volwassen en onvolwassen dieren: elutriatie of Staput (sedimentatie) met behulp van BSA en / of Percoll gradiënten. Beide van deze methoden afhankelijk van celgrootte en dichtheid te scheiden cellen in de meiose 1-5. Het algemeen, behalve voor enkele celpopulaties 6, deze protocollen onvoldoende zuiverheid van de talrijke meiotische celpopulaties die nodig zijn voor gedetailleerde moleculaire analyses opleveren. Bovendien, met dergelijke methoden meestal een soort van cellen in de meiose kan worden gezuiverd op een gegeven tijd, die een extra niveau van complexiteit ten aanzien van de reproduceerbaarheid en de homogeniteit bij het vergelijken van de meiose celmonsters toevoegt. We beschrijven hier een verfijnde methode die het mogelijk maakt een gemakkelijk te visualiseren, te identificeren en meiotische cellen te zuiveren, van kiemcellen te ronden spermatiden, met behulp van FACS in combinatie met Hoechst 33342 vlekken 7,8. Deze methode biedt een algemeen overzicht van het gehele meiotische proces en maakt het mogelijk om zeer zuiveren levensvatbare cellen van de meeste fase van de meiose. Deze gezuiverde cellen kunnen vervolgens worden geanalyseerd in detail voor de moleculaire veranderingen die progressie te begeleiden door middel van meiose, bijvoorbeeld veranderingen in genexpressie 9,10 en de dynamiek van nucleosoom bezetting bij hotspots van meiotische recombinatie 11.

Een efficiënte methode om in hoge mate gezuiverd levensvatbare meiotische fracties te verkrijgen van de muis testis wordt beschreven, die een combinatie van een verfijnde cel dissociatie protocol met TL-geactiveerde cel sortering (FACS). Deze methode maakt gebruik van verschillen in het DNA-gehalte en de nucleaire dichtheid van discrete meiotische fracties.

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

De heterogene aard van de celtypen in de testis en het ontbreken van meiotische celcultuurmodellen zijn aanzienlijke hindernissen geweest voor de studie naar de ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om in één keer en met een hoge zuiverheid een breed scala aan mitotische cellen uit volwassen muizentestikels te zuiveren, om zo de dynamische processen te bestuderen die plaatsvinden tijdens deze unieke celcyclus. Dit wordt bereikt door testiculaire cellen efficiënt te dissociëren met een reeks enzymatische digesties met collagenase en trypsine in aanwezigheid van dna, om in een tweede stap een enkelcellige testikelsuspensie te verkrijgen.De test-suspensie wordt gekleurd met de Hulk's 3 33 42 fluorescerende live DNA-kleurstof, waardoor verschillende mitotische celtypen kunnen worden onderscheiden op basis van hun DNA-gehalte en dichtheid. Vervolgens worden mitotische cellen geanalyseerd via fluorescence-activated cell sorting om alle benodigde fracties te identificeren en te zuiveren voor verdere analyse, zoals cytogenetische of genexpressieanalyse. De resultaten tonen een efficiënte zuivering van moeilijk te verkrijgen mitotische celpopulaties met een hoge zuiverheidsgraad aan, gebaseerd op uitgebreide cytogenetische en expressie-arraystudies.Het belangrijkste voordeel van dit feitelijke protocol ten opzichte van bestaande methoden, zoals centrifugatie, filtratie of sedimentatie door zwaartekracht, is dat het mogelijk maakt om in één keer meiotische fracties van zeer hoge zuiverheid te verzamelen. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen zeer uiteenlopende vaardigheden moeten combineren om een efficiënte weefseldissociatie en staandering uit te voeren, gevolgd door een optimale cellsortering; hierbij zijn een goede interactie tussen de persoon die de cellen voorbereidt en de flowcytometrie-operator, evenals een goed begrip van de fundamenten van dit protocol, essentieel voor het succes. Het protocol voor celdissociatie zal worden gedemonstreerd door Dr. I Gatun, een senior postdoc in ons laboratorium die dit protocol aanzienlijk heeft verbeterd.BVN Tores. Onze operator flowcytometrie zal u begeleiden bij een optimale configuratie voor efficiënte cel sortering. In dit protocol wordt de dissociatie van twee teelballen van volwassen muizen gedemonstreerd, maar de volumes kunnen dienovereenkomstig worden aangepast voor juvenielen of voor extra teelballen.Begin met het toevoegen van drie milliliter gaze gebalanceerde zoutoplossing die 120 units per milliliter collagenase type one bevat aan de buis. Efficiënte dissociatie is cruciaal voor een correcte kleuring en het succesvol sorteren van de cellen. De toevoeging van voldoende collagenase one, alsook het plaatsen van de buis in een horizontale positie tijdens het schudden, is essentieel voor een efficiënte weefseldissociatie. Plaats één ingekapselde testis in een 15 milliliter buis.Voeg 10 µL DNase I toe aan de testis en schud de buis krachtig met de hand totdat de zaadbuisjes beginnen te dissociëren. Plaats de buis vervolgens horizontaal op een rotator en fixeer deze, en agiteer de buis gedurende 15 minuten bij maximaal 120 RPM op 33 °C. Decanteer na 15 minuten gedurende één minuut verticaal bij kamertemperatuur. Gebruik vervolgens een wegwerppipet om het supernatant te verwijderen. Voeg 3 mL gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) bevattende collagenase type I, evenals 10 µL DNase I, toe aan het monster.Schud de buis opnieuw een paar keer met de hand. Agiteer de buis horizontaal met een maximum van 120 RPM gedurende 15 minuten bij 33 °C, zoals eerder gedaan, decanteer gedurende één minuut verticaal bij kamertemperatuur en verwijder vervolgens het supernatant. Voeg daarna 2,5 milliliters GBSS toe dat collagenase bevat.Voeg 50 µL trypsine en 10 µL dase toe. Keer de buis meerdere keren om en agiteer deze horizontaal bij maximaal 120 RPM gedurende 15 minuten bij 33 °C. Gebruik na de agitatie van 15 minuten een wegwerpplastic pastpipet met een brede opening om het monster gedurende drie minuten voorzichtig op en neer te pipetteren.Er mogen op dit punt geen klontjes zichtbaar zijn. Voeg vervolgens 30 µL trypsine, 10 µL DNAs one en 40 µL Hulks 3 33 42 opgelost in DMSO toe. Keer de buis meerdere keren om.Agiteer horizontaal gedurende 15 minuten bij maximaal 120 RPM bij 33 °C. Wanneer de agitatie van het monster is voltooid, voeg dan 400 µL foetaal kalfsserum toe en meng door de buis om te keren om de trypsine te inactiveren. Voeg voor de uiteindelijke kleuring 50 µL hoax 3 33 42 en 10 µL DNAs toe.Agiteer de buis opnieuw horizontaal met een maximum van 120 RPM gedurende 15 minuten bij 33 °C. Het gedissocieerde testismonster wordt vervolgens door twee wegwerpfilters van 40 micron geleid, die zijn bevochtigd met GBSS, in een conische buis van 50 milliliter. Voeg vijf µL propidiumjodide-oplossing toe aan het monster en meng voorzichtig door meerdere keren te pipetteren met een wegwerppastepipet.Breng het monster vervolgens via een 18 gauge naald over naar een plastic spuit van vijf milliliter. Vervang daarna de 18 gauge naald door een 22 gauge naald voor de toediening van het monster. Bewaar de spuit tot slot op ijs en bescherm deze tegen licht totdat het monster klaar is voor fax-verwerking.Voor dit experiment wordt cel sortering uitgevoerd in een Backin Dixon gebied. Twee gebruikte condities voor de cel sorter zijn aangepast van die welke eerder werden gebruikt voor een flowcytometer uitgerust met een 360 nanometer ultraviolette argonlaser en een 488 nanometer argonlaser. Uiteindelijk zal de instelling van de flowcytometer geoptimaliseerd moeten worden door de operator van de cel sorter.Aangezien de Becton Dixon Aria two U geen UV-laser heeft, is het protocol voor het detecteren van Hoeckis-kleuring aangepast met behulp van een 405 nanometer violette laser. Hoeckis wordt geëxciteerd door de 405 nanometer violette laser en een 488 nanometer blauwe laser wordt gebruikt voor zowel de PI-excitatie als de detectie van forward en side scatter. Daarnaast zijn de filters voor de Hoeckis-detectie aangepast om lekken van de rode laser te beperken, wat resulteert in een verbeterde scherpte van de scatterplot.De violette laser is geconfigureerd met een 4 50 40 nanometer banddoorlaatfilter voor de detectie van hoaxed blauwe emissie en een 5 85 42 nanometer banddoorlaatfilter voor hoaxed rode emissie. Een 5 0 2 nanometer langdoorlaatfilter wordt gebruikt om blauwe van rode fluorescentie te scheiden. Het verschil bij het gebruik van twee verschillende filtersets wordt hier getoond.Het 5,85 x 42 nanometer filter levert compactere celpopulaties op dan het 6,30 x 30 nanometer filter. Daarom moet de operator bereid zijn om verschillende combinaties op het eigen instrument te proberen om tot het beste compromis te komen. Er wordt een 100 micron nozzle gebruikt met een druppelafgiftefrequentie van 28.000 druppels per seconde.De drempelwaarde voor de monsters is ongeveer 4 000 events per seconde met een stroomsnelheid tussen één en drie om een hogere resolutie te behouden. Sorteer het monster in aliquots van ongeveer 750 µL die vanuit de spuit worden gedoseerd. Houd tijdens deze pauzes het resterende monster in de spuit op ijs en bescherm deze tegen licht. Verzamel de gesorteerde monsters in glazen boris-collectiebuisjes van 12 bij 75 mm die 250 µL DMEM bevatten, aangevuld met 10% FCS.Om het monster in de opvangbuisjes op vier graden Celsius te houden, dient de temperatuurregeling gedurende de gehele sortering te worden gebruikt. Gebruik daarnaast de monsteragitatie-functie op 200 RPM om te voorkomen dat het monster tijdens de sortering bezinkt. Telkens wanneer een aliquot van het hoofdmonster wordt toegevoegd, is het belangrijk om ook tegen de opvangbuisjes te tikken om de integriteit van de opgevangen cellen te behouden.Hier worden representatieve FACS-profielen getoond waarin alle belangrijke stappen van de meiose bij het wild-type zijn geïdentificeerd in deze scatterplot waar de gegatede cellen zijn aangegeven; er is een grote hoeveelheid debris aanwezig in de adulten testikels, bestaande uit voornamelijk lege membranen en spermastaarten. Een representatieve Propidiumjodide-plot laat zien dat er een zeer beperkte hoeveelheid propidiumjodide-positieve cellen in het monster aanwezig is. De typische gate is aangegeven in dit representatieve wild-type FACS-profiel.De verschillende meiotische celpopulaties die met deze methode kunnen worden gezuiverd voor verdere studie zijn spermatogonia, pre-leptoteen, leptoteen, zygoten, pachytente, diplotene en ronde spermatocyten. Deze laatste twee profielen zijn afkomstig van een SPO11N-testis en een wildtype-testis van 13 dagen oude muizen. SPO11 is de meiotische endonuclease die dubbelstrengs breuken aanstuurt op locaties van meiotische recombinatie-hotspots, en zoals hier waargenomen, leidt de afwezigheid van SPO11 tot een duidelijk meiotisch falen omdat geen enkele fase voorbij de leptotene-zygoot of vroege pachytente fase kan worden gedetecteerd.In tegenstelling hiermee vertoont het profiel van een wild-type mannelijke muis van 13 dagen een hoge concentratie leptine-zygote cellen. Deze eerste golf van meiose is, zoals duidelijk gevisualiseerd, vrij asynchroon. Bij het uitvoeren van dit experiment met deze methodologie is het belangrijk om een voldoende hoeveelheid DNA te gebruiken.De centrale stad is geschikt voor probleemloze sortering. Hoewel onderzoekers aanvankelijk terughoudend zijn om het te gebruiken, zal de toevoeging van DNA de viscositeit van het monster verminderen en de celseparatie en kleuring verbeteren, terwijl intacte cellen niet beschadigd zullen raken. De FOX-methode voor de isolatie van somatische cellen kan worden gebruikt in een breed scala aan downstream-applicaties, zoals bijvoorbeeld DNA-RNA-extractie om genexpressiedynamiek te bestuderen, of voor de chromatine-immunoprecipitatie-techniek om diverse epigenetische profileringen vast te stellen.

flow-cytometry-purification-of-mouse-meiotic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Flowcytometrie gebaseerde Zuivering van<em&gt; S. cerevisiae</em&gt; Zygoten

Een nieuw protocol voor de mechanische voorbehandeling van testiculaire celsuspensies van knaagdieren materiaal vermijden enzymen en wasmiddelen wordt beschreven. De methode is eenvoudig, snel, reproduceerbaar en maakt goede kwaliteit celsuspensies, die geschikt zijn voor flow sorteren en RNA-extractie zijn.

Eenvoudige en doeltreffende techniek voor de bereiding van testikels Cell Schorsingen

We beschrijven een sorteerstrategie voor muis spermatiden met behulp van flowcytometrie. Spermatiden worden ingedeeld in vier zeer zuivere populaties, waaronder ronde (spermiogenetische stappen 1-9), vroege verlengende (spermiogenetische stappen 10-12), late verlengende (spermiogenetische stappen 13-14) en langwerpige spermatiden (spermiogenetische stappen 15-16). DNA-kleuring, grootte en korreligheid worden gebruikt als selectieparameters.

Stap-specifieke sorteren van Muis Spermatiden door flowcytometrie

Wij rapporteren een protocol met behulp van fluorescentie-geactiveerde celsortering met plasmacytoïde dendritische cellen (PDC) met hoge zuiverheid uit het beenmerg van lupus-muizen gevoelig voor functionele studies pDC isoleren.

Fluorescentie-geactiveerde Cell Sorting voor Zuivering van plasmacytoïde dendritische cellen van de muis Bone Marrow

Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.

Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie

Dit artikel illustreert een krachtige methode om te kwantificeren mitochondriën of lysosomen in levende cellen. De combinatie van lysosoom - of mitochondriën-specifieke kleurstoffen met fluorescently geconjugeerde antilichamen tegen oppervlakte markeringen zorgt ervoor dat de kwantificering van deze organellen in gemengde cel populaties, zoals primaire cellen geoogst van weefselmonsters, met behulp van Multicolor stroom cytometry.

Multicolor Stroom Cytometry gebaseerde kwantificering van Mitochondria en lysosomen in T cellen

Gepresenteerd hier is een protocol voor het verrijken van pachytene spermatocyten, ronde spermatiden, en rek spermatiden uit volwassen muis testes met behulp van een discontinu bovine serumalbumine dichtheidsgradiënt met standaard laboratoriumapparatuur.

Verrijking van Pachyteen spermatocyten en spermatiden van muis testes met behulp van Standaard laboratoriumapparatuur

Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.

Isolatie van Murine Spermatogenic Cellen met behulp van een Violet-Excited Cell-Permeable DNA Binding Dye

Deze methode beschrijft de zuivering door flowcytometrie van MEP en MKp van muizendijbenen, tibia's en bekkenbotten.

Isolatie van muizen megakaryocyten voorlopers

Hier beschrijven we een nieuwe flowcytometrische methode voor prospectieve isolatie van vroege burst-forming unit erythroid (BFU-e) en kolonievormende unit erythroid (CFU-e) voorlopers rechtstreeks uit vers beenmerg en milt van muizen. Dit protocol, ontwikkeld op basis van eencellige transcriptomische gegevens, is het eerste dat alle erytroïde voorlopercellen van het weefsel met een hoge zuiverheid isoleert.

Identificatie en isolatie van burst-forming unit en kolonievormende eenheid Erytroïde voorlopers uit muizenweefsel door flowcytometrie

Om muishersencorticale pericyten te verkrijgen die voldoen aan de eisen van scRNA-seq, presenteren we een kritisch geoptimaliseerd FACS-protocol gebaseerd op CD13/CD31⁻-selectie. Onze belangrijke verfijningen verbeteren de levensvatbaarheid van cellen en de integriteit van RNA aanzienlijk, waardoor betrouwbare transcriptomische profilering mogelijk wordt.

Isolatie van pericyten uit muiscorticaal weefsel met FACS voor single-cell sequencing

Leer hoe je meiotische cellen uit muizentestes zuivert met flowcytometrie en fluorescentie-geactiveerde cel sortering. Deze methode maakt hoogzuivere isolatie mogelijk voor cytogenetisch en expressieonderzoek.

Flowcytometrie Zuivering van Mouse cellen in de meiose

Meer video's verkennen