Detectie van Signalering Effector-Complexen Stroomafwaarts van BMP4 gebruik In situ PLA, een Proximity Ligatie Assay

Het algemene doel van het volgende experiment is om BMP-signalering in weefselkweekcellen te visualiseren en te kwantificeren. BMP's binden aan receptoren op het celoppervlak en fosforyleren drie smad-effectoren: smad een, smad vijf en SMAD acht. Deze vormen complexen met smad vier en transloceren naar de nucleus, waar ze de transcriptie coördineren.

Hier maken we gebruik van PLA om complexen te visualiseren die worden gevormd tussen de endogene SMA-effectoren en smad four in kweekcellen met of zonder BMP-stimulatie. Dit begint met het parallel gebruik van twee primaire antilichamen, waarvan er één alle drie de gefosforyleerde SMA-effectoren herkent en de andere smad four herkent; secundaire antilichamen, genaamd PLA-probes, waaraan elk een uniek kort DNA-strand is gekoppeld, binden aan de primaire antilichamen wanneer de PLA-probes zich in nauwe nabijheid bevinden. De DNA-stranden reageren via een daaropvolgende toevoeging van twee cirkelvormende DNA-oligonucleotiden.

Deze worden door middel van enzymatische ligatie aan elkaar gekoppeld en vormen een cirkel die na de amplificatiereactie via rolling circle-replicatie wordt geamplificeerd. Hybridisatie van gelabelde complementaire oligonucleotide probes brengt de fluorescerende vlekken van het product in beeld die geassocieerd zijn met de amplificatie van elk gecirculariseerd DNA-product, welke gemakkelijk zichtbaar zijn.

Wanneer ze onder een fluorescentiemicroscoop worden bekeken, komen de stipjes overeen met complexen tussen effector, seds en smad four, wat duidt op actieve BMP-signalering in de cel. De belangrijkste voordelen van PLA ten opzichte van bestaande methoden zijn dat het eenvoudig in gebruik is, zeer gevoelig is en geen achtergrondruis vertoont, en dat het gebruikt kan worden om actieve BMP-signalering in situ te kwantificeren. De BMP-route is essentieel voor de ontwikkeling van diverse organen en weefsels en voor processen waaronder stamcelproliferatie en -differentiatie.

De PLA kan worden gebruikt om kernvragen te beantwoorden over de dynamiek, niveaus en subcellulaire lokalisatie van BMP-signalering, maar kan ook worden ingezet voor diagnostiek. Omdat deze signaalroute ten grondslag ligt aan verschillende ziekten, kan BLA worden gebruikt om andere signaaltransductiecomponenten van de BMP- of andere routes te bestuderen en kan het worden aangepast voor gebruik op weefselcoupes of volledige embryo's. Om de in situ proximity ligation assay te starten, dienen de celculturen te worden voorbereid; Neuro 2A-cellen worden gekweekt in GMEM aangevuld met 10% FBS, 1x niet-essentiële aminozuren, 1x pyruvaat en 1x L-glutamine.

Splits de cellen met trypsine en zaai 15.000 tot 20.000 cellen per putje. Incubeer de cellen in een 16-well chamber slide gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO2. Na 24 uur.

Vervang het kweekmedium door aangevuld serumvrij GMEM en incubeer de controles nog twee tot drie uur. Houd na de tweede incubatie drie wells met cellen onder normale kweekomstandigheden. Rem het BMP-pad door de cellen te behandelen met twee micromolair dorsamorfine of induceer signalering door de cellen 10 tot 60 minuten te behandelen met BMP4.

Zuig na de celstimulatie het medium uit de wells en was de cellen voorzichtig met PBS om celdetachering te voorkomen. Pipetteer het PBS niet direct op de cellen. Zuig vervolgens het PBS af en verwijder de chambers, maar laat de silicon rond de wells zitten.

Voeg 50 µL vers bereid en gefiltreerd 4% paraformaldehyde toe aan de wells en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Was na de fixatie de cellen gedurende vijf minuten met PBS bij kamertemperatuur met agitatie in een copin-pot. Herhaal het wassen tweemaal voor een totaal van drie wasbeurten.

Maak de cellen vervolgens permeabel met 0,5% Triton X 100 in PBS in een Copin-pot en incubeer ze 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Was de cellen daarna 3 keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met 0,05% Tween 20 en TBS, met agitatie in een Copin-pot. Start de blokkeringsprocedure door op de slide te tikken om de laatste wasoplossing te verwijderen.

Zorg ervoor dat de cellen niet uitdrogen. Voeg aan elke well één druppel DUO-linker toe aan de blokkeringsoplossing. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 °C in blokkeringsoplossing in een voorverwarmde bevochtigingskamer, bestaande uit een lege pipetpuntendoos met gedestilleerd water.

Om de oplossingen van de primaire antilichamen voor te bereiden, wordt anti phospho smad 1 5 8 en anti SMAD four one 1:100 verdund in duo link two antilichaamverdunner. Gebruik elk antilichaam afzonderlijk en in combinatie. Tik nu op de slide om de blokkeringsoplossing van de slide te verwijderen en voeg 40 µL van de antilichaamoplossingen toe aan de betreffende wells; een negatieve controle met enkel verdunner kan worden toegevoegd.

Voer deze stap snel uit om te voorkomen dat de cellen uitdrogen. Incubeer de objectglazen vervolgens gedurende één uur bij 37 °C in een voorverwarmde bevochtigingskamer. Verdun tijdens de incubatie de twee PLA-probes in het verdunningsmiddel.

Meng voor elke reactie acht µL van elke probe met 24 µL verdunner, zodat de probes in de oplossing één op vijf worden verdund. Giet na de incubatie van één uur de primaire antilichaamoplossing af en was de coupes twee keer met Duo link to Wash Buffer a gedurende vijf minuten per keer bij kamertemperatuur onder agitatie in een mengpot. Wanneer het wassen voltooid is, giet het resterende wash buffer A van de coupes af en voeg 40 µL van de PLA-probe-oplossing toe aan elke coupe.

Incubeer de objectglazen nu bij 37 °C in een voorverwarmde, bevochtigde kamer. Bereid gedurende één uur een volume voor de ligatiemix voor met de DuoLink ligatiestam. Doe dit door eerst de DuoLink ligatiestam te vortexen en deze te verdunnen tot 1× in ultrapuur water.

Houd er rekening mee dat het ligase-enzym in een verhouding van 1:40 aan deze oplossing wordt toegevoegd en dat per putje 40 µL van het mengsel nodig is. Tap na de incubatie de PLA-sondeo-oplossing van de coupes af en was deze tweemaal met Wash Buffer A gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met agitatie in een mengpot. Neem bij de laatste wasbeurt Duo link Ligase uit het vriesblok, voeg dit toe aan de ligatie-oplossing tot een uiteindelijke verdunning van 1:40 en vortex.

Tap nu het laatste volume Wash Buffer A van de objectglazen af en voeg 40 µL van de ligatie toe. Meng deze met het enzym terwijl u de glazen licht schudt. Incubeer de objectglazen gedurende 30 minuten in een voorverwarmde bevochtigingskamer.

Ontdooi de DUO link amplificatievoorraad bij 37 °C en bereid de amplificatiestap tijdens de incubatie voor door de DUO Link amplificatievoorraad in ultrapuur water te verdunnen tot een 1× concentratie. Houd de reagentia uit het licht omdat ze lichtgevoelig zijn. Wanneer de ligatiestap is voltooid, giet u de oplossing af en wast u de slides tweemaal gedurende twee minuten per keer met Wash Buffer A bij kamertemperatuur onder agitatie in een mengpot. Voeg tijdens de laatste wasbeurt duo link polymerase toe aan de amplificatieoplossing tot een uiteindelijke verdunning van 1:80 en vortex deze. Nadat de wasbuffer is afgegoten, voegt u 40 µL van het amplificatiemengsel toe aan elke well en incubeert u de slides gedurende 100 minuten bij 37 °C in een donkere, voorverwarmde bevochtigingskamer.

Zodra de amplificatie-incubatie is voltooid, wordt de polymerase-oplossing van de coupes afgegoten en worden deze tweemaal gedurende 10 minuten per wasbeurt gewassen in Wash buffer B in een couplagespot, waarbij de coupes tijdens deze stap uit het licht worden gehouden omdat de reagentia lichtgevoelig zijn. Volg de twee wasbeurten met een dip in 0,1 keer wash buffer B. Verwijder nu het silicon volledig van de 16-well-slide en voeg vervolgens ongeveer 40 µL van de duo toe.

Breng het montagemedium aan op een dekglas en plaats dit voorzichtig over de monsters, waarbij u lichtjes drukt om luchtbellen onder het dekglas te voorkomen. Fixeer en verzegel het dekglas op de objectglas met nagellak en laat dit minimaal 15 minuten rusten vóór het beeldvormen. Dit zijn confocale beelden van cellen die zijn behandeld met 2 µM dorsomorfine, een remmer van de BMP-route, of behandeld met 25 ng/mL BMP4 gedurende 60 minuten.

Antilichamen tegen Phospho Smad 1 58 en Smad vier werden gebruikt om de actieve smad-complexen te detecteren en zijn zichtbaar als rode stippen. De celkern werd blauw gekleurd met dpi. De PLA-signalen werden geteld met de DUO link image tool-software en het gemiddeld aantal stippen in de kern per cel wordt in de grafiek weergegeven.

Er is geen kleuring zichtbaar wanneer een van de primaire antilichamen alleen wordt gebruikt, wat aangeeft dat er geen achtergrondsignaal is van de PLA-probes en de daaropvolgende ligatie van de oligonucleotiden. Evenzo worden er geen spots gedetecteerd in een andere negatieve controle waarbij beide primaire antilichamen zijn weggelaten. In neuro 2A-cellen onthult SDS-PAGE immunoblottings gefosforyleerd SMAD 1 5 8 in onbehandelde en BMP-behandelde cellen.

De niveaus van gefosforyleerd smad zijn echter aanzienlijk verlaagd in de cellen die behandeld zijn met dorsale morfine. Het antilichaam tegen PCNA dient als loading control. Na het bekijken van deze video heeft u een goed inzicht in hoe u de stappen en de opstelling kunt volgen die wij aanbevelen om resultaten te verkrijgen in minder dan zes uur na de fixatie van de cellen.

Samenvattend bestaan de stappen uit het blokkeren, incubatie van het primaire antilichaam, incubatie van de PLA-proben, ligatie-amplificatie, monteren en imaging.