Detectie van Signalering Effector-Complexen Stroomafwaarts van BMP4 gebruik In situ PLA, een Proximity Ligatie Assay
3 maart 2011
Hier laten we zien hoe Proximity Ligatie Assay (PLA), te gebruiken met een combinatie van antilichamen tegen botmorfogenetisch Protein (BMP) signalering in vaste cellen te visualiseren. Deze techniek liet ons toe om de nucleaire accumulatie van endogene BMP geactiveerde effector-complexen te volgen en hun niveaus loop van de tijd te kwantificeren onder BMP4 stimulatie.
Het algemene doel van het volgende experiment is om BMP-signalering in weefselkweekcellen te visualiseren en te kwantificeren. BMP's binden aan receptoren op het celoppervlak en PHOSFOLEREREN drie, smad-effectoren, smad een, smad vijf en SMAD acht. Deze vormen complexen met smad vier en transloceren naar de kern waar ze transcriptie orkestreren.
Hier gebruiken we PLA om complexen te visualiseren die zich vormen tussen de endogene SMA-effectoren en smad vier in weefselkweekcellen met of zonder BMP-stimulatie. Dit begint met parallel gebruik van twee primaire antilichamen, waarvan er een alle drie gefosforyleerde, smma, effectoren herkent, en de andere smad vier herkent. Secundaire antilichamen genaamd PLA-sondes met elk een uniek kort DNA-strengje eraan, binden aan de primaire antilichamen waar de PLA-sondes in de buurt zijn. De DNA-strengen interageren door een daaropvolgende toevoeging van twee cirkelvormige DNA-oligonucleotiden.
Deze worden samengevoegd door enzymatische ligatie en vormen een cirkel die via rollendek replicatie wordt geamplificeerd na de amplificatiereactie. Hybridisatie van gelabelde complementaire oligonucleotidesondes markeert het product van fluorescerende vlekken geassocieerd met de amplificatie van elk gecirculeerd. DNA-product is gemakkelijk zichtbaar.
Bij bezichtiging onder een fluorescentiemicroscoop komen de vlekken overeen met complexen tussen effector, seds en smad vier, die actieve BMP-signalering in de cel aangeven. De belangrijkste voordelen van PLA boven bestaande methoden zijn dat het gemakkelijk te gebruiken is, zeer gevoelig is en geen achtergrond heeft, en het kan worden gebruikt om actieve BMP-signalering in situ te kwantificeren. De BMP-route is essentieel voor de ontwikkeling van verschillende organen en weefsels en voor processen inclusief stamcelproliferatie en differentiatie.
De PLA kan worden gebruikt om belangrijke vragen over BMP-signaleringsdynamica, niveaus en subcellulaire lokalisatie aan te pakken, maar kan ook worden gebruikt voor diagnose. Omdat deze route ten grondslag ligt aan verschillende ziekten, kan BLA worden gebruikt om andere signaaloverdrachtscomponenten van de BMP of andere routes te bestuderen en kan worden aangepast om op weefselsecties of hele embryo's te werken. Om de in situ-proximiteitsligatietest te beginnen, bereid de celculturen voor. Neuro twee A-cellen worden gekweekt in GMEM aangevuld met 10% FBS eenmaal niet-essentiële aminozuren, eenmaal pyruvaat en eenmaal L-glutamine.
Splits de cellen met behulp van trypsine en plaats 15.000 tot 20.000 cellen per put. In een 16-puts kamerschijven, incubeer de cellen gedurende 24 uur bij 37 graden Celsius in een bevochtigde 5% koolstofdioxide-incubator. Na 24 uur.
Vervang het kweekmedium met aangevuld serumvrij GMEM en incubeer nog twee tot drie uur voor controles. Houd drie putten met cellen onder normale kweek- en omstandigheden na de tweede incubatie. Inhibeer de BMP-route door de cellen te behandelen met twee micromolar dorsa morfine of induceer signalering door de cellen te behandelen met BMP vier gedurende 10 tot 60 minuten.
Na de celstimulatie, aspireer het medium uit de putten en was de cellen voorzichtig met PBS om celdetachment te voorkomen. Pipetteer het PBS niet direct op de cellen. Aspireer vervolgens de PBS en verwijder de kamers, maar laat het siliconen om de putten.
Voeg 50 microliter vers bereid en gefilterd 4% para formaldehyde toe aan de putten en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Na de fixatie, was de cellen met PBS gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur met agitatie in een copin-pot. Herhaal de wassing twee keer voor een totaal van drie wasbeurten.
Permeabiliseer vervolgens de cellen met 0,5% Triton X 100 in PBS in een copin-pot en incubeer ze gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur zonder agitatie. Was vervolgens de cellen met 0,05% tween 20 en TBS 3 keer gedurende vijf minuten per wassing met agitatie in een koppelingspot. Start de blokkeerprocedure door op de dia te tikken om de laatste wasoplossing te verwijderen.
Zorg ervoor dat de cellen niet drogen. Voeg een druppel DUO link naar blokkeeroplossing toe aan elke. Put. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius in een voorverwarmde bevochtigde kamer bestaande uit een lege pipettipdoos met gedistilleerd water.
Om de primaire antilichaamoplossingen voor te bereiden, verdun anti-fosfo smad 1 5 8 en anti SMAD vier een op 100 in duo link twee antilichaamverdunner. Gebruik elk antilichaam afzonderlijk en in combinatie. Tik nu op de dia om de blokkeeroplossing van de dia te verwijderen en voeg 40 microliter van de antilichaamoplossingen toe aan de juiste putten en negatieve controle. Met alleen verdunning kan worden opgenomen.
Doe deze stap snel zodat de cellen niet uitdrogen. Incubeer nu de dia's gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een voorverwarmde bevochtigde kamer. Tijdens de incubatie verdunt u de twee PLA-sondes in verdunning.
Voor elke reactie meng acht microliter van elke sonde en 24 microliter van verdunning, zodat de sondes verdund zijn met een op vijf in de oplossing. Na de incubatie gedurende één uur, tik de primaire antilichaamoplossing af en was de dia's twee keer met Duo link naar Wash Buffer a gedurende vijf minuten elk bij kamertemperatuur met agitatie in een koppelingspot. Wanneer de wasbeurten voltooid zijn, tik de resterende wasbuffer A van de dia's en voeg 40 microliter van de PLA-sondeoplossing toe aan elk.
Incubeer nu de dia's gedurende één uur bij 37 graden Celsius in een voorverwarmde bevochtigde kamer. De duo link naar ligatiestock en bereid een volume voor voor de ligatiemix. Door de duo link naar ligatiestock eerst te vortexen en het verdunnen tot eenmaal in hoogzuiver water.
Houd er rekening mee dat het ligase-enzym één op veertig in deze oplossing wordt toegevoegd en dat 40 microliter van de mix per put nodig is. Na de incubatie, tik de PLA-sondeoplossing van de dia's en was ze twee keer met Wash Buffer
Overzicht
Deze studie toont het gebruik van Proximity Ligation Assay (PLA) om Botenmorfogenetisch Proteïne (BMP) signaaltransductie in gefixeerde cellen te visualiseren. De techniek maakt de kwantificering mogelijk van BMP-geactiveerde effectorcomplexen in de loop van de tijd onder BMP4-stimulatie.
Belangrijkste onderdeel van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Signaaloverdracht
Achtergrond
- BMP's zijn cruciaal voor orgaan- en weefselontwikkeling.
- Ze reguleren processen zoals stamcelproliferatie en differentiatie.
- Inzicht in BMP-signaaldynamiek is essentieel voor het aanpakken van gerelateerde ziekten.
- PLA biedt een gevoelige methode om deze signaalroutes te bestuderen.
Doel van het onderzoek
- Om BMP-signaaltransductie in weefselkweekcellen te visualiseren.
- Om de vorming van effectorcomplexen in reactie op BMP-stimulatie te kwantificeren.
- Om de voordelen van PLA ten opzichte van traditionele methoden te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Celkweek van Neuro 2A-cellen onder specifieke omstandigheden.
- Gebruik van primaire antilichamen om gefosforyleerde SMAD-effectoren en SMAD4 te detecteren.
- Toepassing van PLA-sondes voor nabijheidsligatie.
- Fluorescentiemicroscopie om complexen te visualiseren die gevormd worden tijdens BMP-signaaltransductie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle visualisatie van BMP-signaalcomplexen in cellen.
- Kwantificering van actieve BMP-signaalniveaus in de loop van de tijd.
- Demonstratie van de gevoeligheid en gebruiksgemak van PLA.
- Mogelijke toepassingen voor het diagnosticeren van ziekten gerelateerd aan BMP-signaaltransductie.
Conclusies
- PLA is een effectieve methode voor het bestuderen van BMP-signaaldynamiek.
- De techniek kan worden aangepast voor verschillende experimentele omstandigheden.
- De verkregen inzichten kunnen bijdragen aan het begrijpen van BMP-gerelateerde ziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Detection of endogenous BMP signaling effector complexes using in situ PLA provides a sensitive, quantitative readout of pathway activation in fixed cells. This enables mechanistic de-risking of BMP-targeted therapeutic hypotheses by distinguishing between phosphorylation and functional complex formation. The assay supports target validation and assay development in early discovery by delivering spatially resolved, background-free quantification of signal transduction events.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of BMP signaling hypothesis by measuring endogenous phospho-Smad1/5/8–Smad4 complex formation as a functional readout of pathway activation.
- Operational Value: Provides high-sensitivity, low-background quantification of effector complexes, reducing false positives from phosphorylation-only detection methods.
- Predictive Value: Supports target confidence by distinguishing between Smad phosphorylation and nuclear translocation into transcriptionally active complexes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates discrete, countable fluorescent spots amenable to automated imaging and quantitative analysis for hit confirmation in screening campaigns.
- Reproducibility: Delivers standardized, amplification-based signal output that minimizes variability across operators and experimental runs.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and adaptable to high-content imaging platforms for longitudinal pathway modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links BMP signaling dynamics to pathophysiological processes in development, stem cell regulation, and tissue homeostasis relevant to degenerative and oncological indications.
- Translational Continuity: Enables comparison of pathway activity across in vitro models and primary tissues, supporting biomarker alignment in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether observed Smad phosphorylation translates into functional effector complex formation, reducing attrition due to incomplete pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing a quantitative, spatially resolved readout of BMP signal transduction competence.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by measuring the formation of endogenous Smad effector complexes as a direct readout of BMP4-induced signaling.
- Screening: Enables assay readiness through standardized, amplification-dependent spot formation that allows compound-induced pathway modulation to be quantified with high sensitivity.
- Analytics: Delivers quantitative nuclear spot counts per cell that facilitate comparison of signaling dynamics across time points, doses, and genetic or pharmacological perturbations.
- Translational Research: Connects in vitro BMP signaling measurements to pathophysiological relevance through subcellular localization and complex-specific detection, supporting biomarker-aligned preclinical models.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable proximity detection platform adaptable to other signaling pathways (e.g., TGF-β, Wnt) via antibody pair substitution, maximizing reagent and workflow investment.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in BMP target validation by resolving active signaling complexes from inert phosphorylation events.
- Operational Value: Ensures reproducibility and standardization through enzymatic amplification and defined oligonucleotide ligation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by reducing mechanistic ambiguity in early-stage BMP pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of BMP-modulating compounds based on functional complex formation rather than surrogate phosphorylation markers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence, antibody validation, and fluorescence microscopy for spot detection and quantification.
- Dependent on access to Duolink PLA kit components, including PLA probes, ligation, and amplification enzymes, and a fluorescence microscope with appropriate filter sets.
- Necessitates standardization of fixation, permeabilization, and blocking conditions across laboratories to ensure consistent probe accessibility and signal-to-noise ratios.
- Adaptation to primary tissues or whole embryos requires optimization of permeabilization and antibody penetration while preserving subcellular localization of signaling complexes.
- Practical limitations include dependency on high-quality, validated antibody pairs and potential steric hindrance in densely packed subcellular compartments affecting probe proximity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Title
2:56
Plating of Cells and Treatment with BMP
4:12
Fixation and Permeabilization
10:56
In Situ Proximity Ligation Assay Results from Neuro2a Cells Treated with BMP4
6:49
The Proximity Ligation Assay (PLA)
5:26
Blocking and Primary Antibodies Application
9:54
Preparation for Imaging
12:18
Conclusion
